成骨细胞分化调控概览

The Regulatory Landscape of Osteogenic Differentiation Abstract 间质干细胞（MSCs）向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的部分，当它被不 恰当地调控时，可能产生疾病，比如骨癌或骨质疏松。利用无偏倚的高通量方法，我们描 述了在人类 MSCs 向骨谱系分化的过程中，基因表达，组蛋白修饰，以及 DNA 甲基化方面 整体改变的图景。此外，我们第一次提供了一份基因组范围上的，关于骨主要调控转录因 子 Runt 相关转录因子 2（RUNX2）在人类成骨细胞中 DNA 结合位点的描述，显示出目标基 因与增殖，迁移及凋亡调控有关，并与 p53 调控的基因有明显的重叠。这些发现扩展了正 在出现的证据，这些证据是关于 RUNX2 在癌症，包括骨代谢，以及 p53 调控网络中有作用 的。我们进一步揭示了 RUNX2 结合在远端的调控元件，启动子上，还有很高的频率结合在 基因的 3末尾上。最后，我们识别出了 TEAD2 和 GTF2I 是一种新的成骨调控因子。 Introduction 间质干细胞或者基质细胞（MSCs）有多谱系潜能，可以向成骨，成脂，成软骨，还有 其它谱系分化（1） 。MSCs 出现在骨髓和其它间质组织中，可能迁移到损伤或炎症处，参与 组织修复（2） 。MSCs 可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化，这为从分子上研究成骨提 供了方便的工具（1） 。关于这一过程的更多知识，对基础研究及 MSCs 在骨骼再生医学上 的临床应用都是十分重要的（3 ） ，同样地，理解它在骨病中失调的情况也很重要，比如说 癌症。在这点上，非常有意思的是骨肉瘤，最常见的骨原发恶性肿瘤，可能是由基因及表 观遗传上的改变打断了 MSCs 向成骨的分化所致（4 ） 。 干细胞分化受基因表达的变化所高度调控，这种变化在转录水平上与 DNA 或染色质结 合在转录调控子上有关，或是与染色质图像的局部改变有关（57） 。高通量方法的发展， 比如 RNA 测序（RNA-Seq） ，以及染色质免疫沉淀及测序（CHIP-Seq） ，使人们可以对这种改 变。在基因组水平上进行描述（8，9 ）举例来说，RNA-Seq 可以系统性地发现启动子与外 显子的轮流使用（10） ，而 CHIP-Seq 显示特定的组蛋白修饰区域，以及这些变化是如何改 变基因活性的（5，8） 。CHIP-Seq 也使人们可以发现基因组结合位点，并为广泛的转录因子 （TFs）寻找目标基因（ 11，12） 。此外，综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区 域，比如启动子和增强子，这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点（TFBS）分 布，以帮助发现新的生物过程调控因子（5） 。 在单倍体 RUNX2 缺乏患者中的骨骼发育缺陷（13） ，或是 Runx2 缺合子（nullizygous ） 小鼠中骨化骨的缺失（14，15） ，揭示了 RUNT 相关转录因子 2（RUNX2，即 CBFA1）对于 骨的发育是不可或缺的。在成骨中，RUNX2 涉及调控增殖，迁移，定型，以及向成骨谱系 的分化（1619） 。RUNX2 对上游信号起反应，调控基因的表达，这些上游信号包括 TGFB，BMP 及 Wnt 信号通路（2023） ；但是，成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那 么好。除了它在发育和失调中的作用，RUNX2 还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2 与 MYC 原癌基因协同，在造血谱系中启动瘤变发生（24 ） ，近期的证据提示在乳腺癌和前列 腺癌细胞中，RUNX2 的肿瘤生长和代谢属性（2527） 。在骨肉瘤中，RUNX2 常常是过度表 达的，这与预后不良有联系（28） 。有趣的是，关于 RUNX2 和 p53 相互作用的证据开始浮 现，包括因 DNA 损伤所致的 RUNX2 抑制 p53 介导的基因表达（29） ，以及 p53 依赖性 RUNX2 蛋白水平调控的证据（30） 。 我们描述了从非肿瘤生成性，不死化的 MSC 细胞系向成骨分化过程中的转录组及表观 基因组上的特征。此外，我们第一次报导了骨主要调控因子 RUNX2 在人类成骨细胞中的基 因组范围的结合位点，并揭示了 2000 多个目标基因，这些目标基因为研究骨生物学中 RUNX2 的转录调控作用提供了新的亮光。我们也利用组蛋白 CHIP-Seq 产生的表观基因组特 点来识别与分化诱导性染色质改变有关的启动子，并预测 TEAD2 和 GTF2I 是这些启动子的 新调控因子。最后，通过沉默 TEAD2 和 GTF2I 的表达，我们确认了这些转录因子在调控成 骨分化方面的作用。 Materials and Methods 暂略 RESULTS iMSC#3 细胞向成骨谱系分化引起基因表达的整体改变 为了研究从 MSCs 开始的成骨分化，我们使用了我们实验室产生的非肿瘤形成性细胞 系（iMSC#3） ，办法是通过端粒酶的异位表达（Skarn et al.,manuscript submitted for publication）从而不死化。这个细胞系可以受转录操控，并且在多次传代后仍然有多谱系 分化潜能。甚至，在基因表达水平上，iMSC#3 细胞非常像人原始 MSCs，提示细胞的不死 化没有彻底改变它们的 MSC 特性（Supporting information Fig.S1） 。为了成骨，iMSC#3 细胞 被放在 DM 中培养 28 天，强力茜素红 S 染色提示矿化基质形成（Fig.1A） 。为了进一步检验 分化的程度，用 RNA-Seq 技术从未分化细胞（Day 0）和分化细胞（Day 28）中测定了基因 整体表达情况，并做对比。我们所发现的在分化中上调或下调的转录物，其所对应的基因 分别为 1462 个和 1695 个，幅度至少是 2 倍或更多（Fig.1B ） 。复制实验显示出高水平相关 性（Supporting information Fig.S2） 。使用精巧路径分析（IPA ） ，我们发现上调基因与增殖， 细胞死亡，骨骼发育，以及细胞运动相关，而下调基因与细胞周期调控有关（Fig.1C） 。已 知的成骨标志物，包括 ALPL（碱性磷酸酶） ，RUNX2 ，ATF4（活化转录因子 4） ，OMD （骨 调蛋白） ，以及 FOXO1（叉头框 O1）被发现是上调的，而 MSC 标志物，包括 MCAM（黑色 素细胞黏附分子） ，ENG（内皮糖蛋白） ，CLCF1（心肌营养蛋白样细胞因子 1） ，TPM1（原 肌球蛋白 1） ，以及 CD44（CD44 分子印度血型）被发现是下调的（ Fig.1D） 。 分化 iMSC#3 细胞的表观遗传分布 为了研究成骨过程中基因组范围的表观遗传改变，我们在 0 天和 28 天时，利用 CHIP- Seq 描述了代表着染色质不同功能状态的组蛋白 H3 修饰的分布情况。我们检验了 H3K4m3 的分布，它在启动子中很丰富（8，36） ，H3K9ac 和 H3K27ac 的分布，它们在活化调控元件 中很丰富（37， 38） ，H3K36m3 的分布，发现于活化的已转录基因中（ 36） ，以及抑制性修 饰 H3K27m3 的分布，典型情况下它分布广泛，覆盖启动子，编码区，以及基因间区 （8 ， 39） 。关于 0 天和 28 天时 ALPL 位点的 CHIP-Seq 及 RNA-Seq 富集分布图已给出 （Fig.2A ） 。该图显示转录水平下调，这与 H3K4m3 和 H3K36m3 分别在启动子和编码区的富 集程度上升相一致。多个 H3K27ac 及 H3K9ac 峰提示转录元件活化，而在基因的上游发现 H3K27m3 甲基化受抑制（Fig.2A） 。 分化伴有染色质图景的变化 为了从整体上分析组蛋白修饰的改变，我们计算了整个基因组中读取区域相对于 500bp 区域的倍数变化（Day 28/Day 0） （the fold changes of reads aligning to 500bp regions throughout the genome was calcuated） 。总的来说，我们发现分化诱导的 H3K4m3，H3K9ac，H3K27ac，以及 H3K36me3 的富集显示出正相关性，而抑制性甲基化的 改变很大程度上与活化标志物的改变呈负相关（Fig.2B） 。我们进一步发现分化的诱导伴随 着全基因组范围上的 H3K9 及 H3K27 的乙酰化缺失，而 H3K4m3 和 H3K27m3 的总体水平仍 然相对恒定（Fig.2C; 所有区域） 。把这种分析限定在基因启动子周围，我们发现乙酰化总 体上缺失，但不是基因组范围上的，而 H3K27m3 富集程度在启动子处是总体上升高的 （Fig.2C; 2kb of 5） 。H3K4m3 在启动子处的富集率保持不变（Fig.2C; 2kb of 5） 。启动 子区域数量很大，显示组蛋白富集程度在相应基因转录水平未发生变化的情况下增加或减 少了（Fig.2D） 。特别是，数千个启动子处乙酰化的减少，伴有 H3K9 和 H3K27 之间极大范 围的重叠（数据未给出） ，影响那些涉及基因调控，细胞生存，生长，以及增殖的基因 （Fig.2D,2E） 。有趣的是，在其启动子处 H3K27m3 水平增高或降低的基因，与肿瘤发生有 很强的关联。H3K27m3 富集程度的增加与神经系统发育有很强的关系（Fig.2E） 。对 H3K4m3，其富集程度增加与发育过程相关，而降低与细胞周期有关（Fig.2E） 。 一般来说，表达上调与 H3K4m3，H3K9ac 以及 H3K27ac 富集程度增加呈正相关 （Supporting information Fig.S3） 。对 H3K27m3 的变化与基因总体水平上的表达情况之间没 有发现什么相关性（Supporting information Fig.S3） ，分别只有 131 个上调的基因和 81 个下 调的基因在其启动子区域显示出明显的富集程度变化（数据未给出） 。IPA 分析发现这些基 因功能上没有明显的富集。 除了组蛋白修饰，我们还研究了 0 天和 28 天时，450000 个 CpG 位点上 DNA 甲基化的 总体变化，使用的是 HumanMethylation450 BeadChIP 试验。这种试验覆盖了 99%的 Refseq 基因，每个基因平均覆盖 17 个 CpG 位点。我们发现只有 1273 个 CpG 位点的甲基化状态发 生了改变，其中 1121 个位点甲基化程度降低，152 个位点甲基化程度增高。甲基化状态变 化与 710 个基因相关，平均每个基因 1.7 个 CpG 位点，只有 27 个受影响的基因超过了 2 个 CpG 位点（Supporting Information Fig.S4; Supporting Information Table S4） 。因此，DNA 甲基化保持着相对恒定，在控制 MSCs 向肿瘤生成方向分化方面，没有表现出重要的调控 作用。 RUNX2 基因的替代性转录变异 已知 RUNX2 是成骨分化的主要调控者，我们更详细地研究这个基因的表达情况。在 0 天细胞中，通过 RNA 测序发现主要的转录源自 P1 启动子（ Fig.3A） 。在诱导分化时，上游 的 P2 启动子受诱导，正如从第 28 天的两个第一外显子（ first exon）RNA 测序数据增加所 显示的那样（Fig.3A） 。另外，第 28 天时 P2 启动子处的 H3K4m3，以及在 P2 和 P1 启动子 之间的编码区域中的 H3K36m3 富集程度的增加，支持了 P2 转录起始位点的分化诱导性激 活（Fig.3A ） 。TaqMan qPCR，使用覆盖两个不同外显子连接处的引物（如 Figure 3A，3B 所 示） ，证实了 P2 启动子的转录显著增强，而 P1 启动子只有轻微的增加（Fig.3C） ；但是，没 有发现蛋白质水平上的增加（Fig.3D） 。有趣的是，位于 RUNX2 基因外显子 2 和外显子 3 之 间的一个非 RefSeq 但却被 ENCODE 注释过的外显子，其表达情况受到了分化的诱导 （Fig.3A, 3B; 星号） 。包含这一外显子的转录产物没有被任何下游的外显子读取，RNA-Seq 队列数据（Supporting Information Fig.S5）证明了这一点，并且成为来自 RUNX2 位点的上调 转录产物的重要部分。这段与 ENCODE 注释的转录产物（Fig.3A）相应的短 RNA 功能位置， 但预计编码蛋白质。 从基因组范围上描述成骨主要调控因子 RUNX2 的结合位点 为了识别成骨细胞中的 RUNX2 目标基因，我们用针对 RUNX2 的单克隆抗体做了 ChIP- Seq，以找出分化的 iMSC#3（第 28 天）细胞中基因组范围上的结合位点。为了确认，我们 还在原始 NHOst 成骨细胞中做了 RUNX2 ChIP-Seq。在 iMSC#3 细胞中通过标记 50kb 区域内 最近的 5末端（by annotation to the closest 5 gene end within a 50kb region） ，发现了总数为 9549 的 RUNX2 区域（Supporting Information Table S5） 。结合位点分布在接近基因的位置， 以及远处（Fig.4A） 。在第 28 天的 iMSC#3 细胞内 500 个最富集的峰值点中的 92%，以及第 28 天的细胞内 4000 个最富集的峰值点中的 76%，在 NHOst 细胞中也是富集的（Fig.4B） 。 从头计算（De novo）模体发现在 RUNX2 峰值处产生了一个模体，与 RUNX 家族模体序列 有 99%相同，这进一步支持了 RUNX2 的特定富集（Fig.4C ） 。 我们发现了 2167 个 ENSEMBL 与 RUNX2 结合的基因，结合位置在 5末端或 3末端的 2kb 内，并把这些基因定义为 RUNX2 目标基因（Supporting Information Table S6） 。 RUNX2 目标基因的 IPA 分析显示这些基因与分子和细胞功能高度显著相关，这些功能涉及 细胞生长与增殖，细胞运动，细胞死亡与生存，发育，以及细胞装配与形成组织（Fig.4D, Supporting Information Table S7A） 。我们发现癌症相关功能基因富集程度很强（Fig.4D Supporting Information Table S7B） ；包括识别出了 IPA 数据库中已知是 p53 调控网络中一部 分的 154 个 RUNX2 目标基因（Fig.4E, Supporting Information Table S8） 。此外，RUNX2 目标 基因与血小板源性生长因子 （PDGF BB） ，Fas 配体（FAS） ，-联蛋白，以及转化生长 因子 1 （TGF1）信号通路有关（Fig.4E, Supporting Information Table S8） 。有趣的是，我 们发现命中的这些基因编码已知的 RUNX2 相互作用伴侣（protein interaction partners） ，包 括 ATF4，STAT1，以及 FOS（Supporting Information Table S6, Supporting Information Fig.S9） ， 提示这些蛋白质之间存在调控回路。 为了研究 RUNX2 结合的潜在功能性应用，我们检验了 RUNX2 目标基因的表达动态， 以及 RUNX2 结合位点的组蛋白修饰动态。首先，我们发现第 28 天时 372 个上调的基因和 339 个下调的基因与 RUNX2 结合（Supporting Information Fig.S6A, Supporting Information Table S9） ，这意味着在我们的成骨模型中，所有分化性表达的基因中有 30%左右在第 28 天 时是与 RUNX2 结合的。这些基因中大部分之前没有被描述过是 RUNX2 的目标基因。IPA 分 析显示那些基因与增殖，迁移以及细胞死亡与发育的过程相关，上调的基因中相当一部分 与骨骼发育和功能有关（Supporting Information Fig.S6B） 。然后我们继续研究了把第 28 天 和第 0 天对比，RUNX2 与分化性表达基因相关的区域结合，是否也在组蛋白修饰状态上显 示出变化；但是，只有不到 1%的区域受到了影响（Supporting Information Fig.S6C） 。这提 示组蛋白修饰方面的改变并不是分化期间 RUNX2 与基因近端位点结合的主要调控因素，至 少不是这次研究的这些修饰。最后，我们看过了所有 RUNX2 结合区域的组蛋白修饰状态， 发现有 100 到 200 个区域受到 H3K4m3，H3K9ac，或 H3K27ac 变化的影响，富集程度增加 的区域比富集程度减少的区域更多（Supporting Information Fig.S6D） 。几乎没有 RUNX2 结 合位点受 H3K27m3 变化的影响。我们还发现 RUNX2 结合位点处的组蛋白修饰变化更多地 出现在那些远端位点上（距基因起始处或结束处2kb） ，而不是那些近端位点（距基因的 5端或 3端2kb 内） 。总的来说，RUNX2 似乎不会因为分化诱导的组蛋白富集程度变化而 去结合到基因组位点上。Supporting Information Figure S7 勾勒了识别 RUNX2 结合区域的实 验工作流程。 从 RUNX2 峰值点的总列表中，我们识别出了 97 个与 RUNX2 结合有关的 microRNA（miRNA）miRBase 注释序列（Supporting Information Table S5） 。源自 miRBase 的 序列代表着一种 miRNA 转录产物中预计的发夹部分，不包含原始转录产物的全长度信息。 因此，对于这些基因我们无法确定 RUNX2 是结合在 5端还是 3端，正如对其它类型基因一 样。但值得注意的是在注释的 miRNA 近端发现了很强的 RUNX2 富集，这些 miRNA 已知有 骨生物学方面的作用，包括 mir23a-27a-24-2 蔟集，mir-22，mir-21，mir-143，mir- 145，mir-221，以及 mir-2144047（Supporting Information Fig.S8） 。其它伴有 RUNX2 强烈 富集的 miRNA 基因包括 mir-4530，mir-3619 ，mir-let7a3 以及 let7b，mir-612 以及 mir199a1（Supporting Information Fig.S8） 。 RUNX2 与基因 5端和 3端结合的频率是差不多的，在基因内区域出现的频率高于基因 间区域（Fig.4F） 。所有 RUNX2 结合区域中差不多一半也有 H3K27ac 的富集，并且这些区域 中大约三分之一也被 H3K4m3 结合（Fig.4G） 。这提示 RUNX2 结合同时激活了启动子和增强 子。只有一小部分仅与 H3K4m3 重叠。我们发现基因的 5 端大部分有 H3K27ac（接近 75%）及 H3K4m3（50%）的富集，提示 RUNX2 启动子结合主要发生在转录活化基因处。在 基因的 3端区域，与启动子处相比，较少与 H3K27ac 和 H3K4m3 重叠（Fig.4G） 。COL1A1 基 因处 RUNX2 和组蛋白 ChIP-Seq 分布情况是上述类型的一个例子（Fig.4H） 。在 RUNX2 的所 有目标基因中，901 个基因只有 5端结合，724 个基因只有 3端结合，而 541 个基因既有 5端结合也有 3端结合（Fig.4I; Supporting Information Table S10A-S10C） 。IPA 分析显示， RUNX2 结合在 5端还是 3端，结合位点不同，基因的细胞学功能也不同（Fig.4I ） 。5 端和 3 端都有 RUNX2 结合的基因与细胞的运动和发育显著相关，就像 ERK，PDGF BB，以及 TGFB 上游信号一样，而 5端结合 RUNX2 的基因与细胞间信号传递有关，3 端结合 RUNX2 的基因 与细胞死亡和生存有关（Fig.4I ，4J） 。更多关于 RUNX2 在目标基因处的 ChIP-Seq 富集分布 情况请见 Supporting Information Fig.S9。 调控肿瘤形成的新 TFs 的识别 为了识别出涉及调控肿瘤形成分化的其它及潜在新转录因子（TFs） ，我们在启动子和 增强子中做了 TFBS 富集分析，分析的是 H3K4m3，H3K9ac 及 H3K27ac 在第 28 天时相对于 第 0 天时富集程度增加的情况，用的是 Uniprobe，Jaspar ，以及 Transfac 数据库。H3K4m3 区域是唯一非常明确的有分化模体显著富集的区域的集合，所以我们把我们的分析集中到 这种组蛋白标记物上。为了进一步缩小研究范围，我们找到了那些专门位于基因启动子上 （离基因 5端2kb）的模体，分化后这些启动子上 H3K4m3 的富集程度增加，而那些模体 也上调了基因的表达，这是将第 28 天与第 0 天的 RNA 测序结果进行比对得出的（ To further narrow down the search,we looked for motifs exclusively in promoters(2kb from 5gene end)of genes with increased H3K4m3 enrichment in their promoter after differentiation, and which also had upregulated gene expression, as determined by RNA-Seq, at Day 28 relative to Day 0） 。用于识别新 TFs 的一个流程概括请见 Supporting Information Figure S10。iMSC#3 细胞中表达程度无法察觉的 TFs 的模体被排除在外，剩下的最显著的模体是属于 TEA 域家 族成员 2（TEAD2） ，PURA ， GTF2I 重复域内容 1（GTF2IRD1 ） ，锌指蛋白 148（ZNF148 ） ，以 及通用转录因子i 的（GFT2I） （Fig.5A） 。在这些模体中， TEAD2 模体是最常出现的， 而 在含有每种模体的启动子中都存在广泛的重叠，特别是 TEAD2，GTF2IRD1 以及 PURA（Fig.5B） 。为预测 TEAD2 目标基因而做的 IPA 分析显示它与细胞形态，发育（包括骨 骼发育，数据未列出） ，生长，以及增殖，细胞运动及细胞死亡有关（Fig.5C） 。为了研究每 种 TF 在成骨过程中起的潜在调控作用，在 iMSC#3 细胞分化期间，用两段分开的小片段干 扰 RNAs（siRNAs）重复敲除掉每种 TF 的表达。对每种 TF 的这种 siRNA 处理重复了 710 次， 在每次敲除 72 小时后用定量 PCR 测定了敲除效率（Supporting Information Fig.S11） 。第 28 天时，细胞培养基用茜素红染色，成像，染色也充当测定分化的手段。对 GTF2I 和 TEAD2，与同样使用 siRNA 处理的对照组细胞相比，染色显著减少（Fig.5D,5E） ，强烈提示 由于敲除，分化受到了特别的抑制。对 GTF2IRD1 和 ZNF148，在其中一份经 siRNA 处理的 细胞中观察到了染色显著减少的现象，但其它细胞中未发现（Supporting Information Fig.S12） 。对 PURA 的敲除，我们没有观察到在矿化方面有任何显著的影响（Supporting Information Fig.S12） 。 DISCUSSION 我们使用了不死化的非肿瘤生成性 MSC 细胞系，iMSC#3，以研究成骨分化期间基因调 控变化。分化伴随着基因表达的变化，这些基因表达与分裂下降有关，同时那些设计成骨 功能的基因表达上调，正如其他人观察到的那样（48，49） ，并且与“分化跟细胞周期进展 停滞有关”的观念相吻合。另外，与细胞死亡和生存的基因上调了，这与之前观察到的成 骨矿化中涉及的凋亡过程相一致（50） 。此外，涉及细胞运动的基因上调，提示离体成骨过 程中细胞迁移起一定的作用。第 28 天细胞中，这些基因的一部分与 RUNX2 结合 （Supporting Information Fig.S6） ，支持了之前关于 RUNX2 是成骨分化过程中迁移调控因子 的发现（19） 。 基因表达的上调和下调分别与活化组蛋白修饰富集程度的增加和减少呈相关关系，正 如其他人报导的那样（5，8） 。不过，已经知道 H3K27m3 的动态变化发生在胚胎干细胞分 化期间的启动子位置上（8， 39） ，仅影响少数分化性表达的基因，因此似乎对 MSCs 向成 骨方向分化的调控意义不大。但是，在很多表达程度没有发生可察觉变化的基因的启动子 上，发现了广泛的表观遗传重塑。我们发现涉及神经形成的基因启动子处 H3K27m3 富集程 度增加，提示 MSCs 的神经分化潜能在其向成骨方向分化时受到了限制。值得注意的是， 已发现 Zeste2 增强子的抑制，即 H3K27m3 的转甲基酶反应，能增强 MSCs 向神经方向的分 化（51 ） 。反过来，在 IPA 分析中，启动子区域 H3K27m3 富集程度下降或 H3K27ac 富集程 度增加的那些基因，跟肿瘤形成有强烈的关系，提示组蛋白修饰情况的改变与基因处发生 的基因活化有关，这对它们在肿瘤发展过程中失调的观点提出了质疑。总体上来说，这些 变化可以涉及到某种图式形成前机制中，这种机制在细胞执行下一阶段生长程序之前，控 制着基因的活化或抑制。 此外，我们发现分化诱导基因组范围上的组蛋白 H3K9 和 H3K27 乙酰化水平降低。以 前曾经描述过，在 MSCs 向成骨方向分化期间，基因启动子处 H3K9ac 富集程度总体上降低 （52 ） 。而且，在成肌，成脂，星形细胞以及少突细胞分化中也发现了组蛋白乙酰化水平降 低（7 ， 53，54） 。合起来，这些发现提示在细胞分化中，启动子处以及远端调控元件处的 去乙酰化可以是一种普遍现象，或许与染色质局部范围凝聚有关，这种凝聚使基因自由度 变小，而基因的自由度跟转录和分化潜能是有关的。乙酰化减少的机制可能是组蛋白乙酰 基转移酶和组蛋白脱乙酰基酶活性之间平衡的移动，或是潜在组蛋白分裂（potentially histone cleavage） （55） 。 RUNX2 表达的研究表明第 28 天时 P1 和 P2 启动子都有转录，提示这两种同工蛋白出 现在分化细胞中。这两种同工体蛋白质之间只有 N 端 19 个氨基酸不同（56） 。从突变小鼠 中得到的证据提示，这两者中任意一种的使用起的作用更像是在整个发育期促进 RUNX2 表 达的空间调节，而不是产生两种不同功能的蛋白质（57） ；但是，也有人报导了这两种蛋白 质之间功能上的不同（56） 。匪夷所思的是，分化过程伴有 RUNX2 转录物水平的强烈增高， 而这在蛋白质水平上并没有反映出来，这些蛋白质与一种短转录产物的产生有相关关系， 这种转录产物终止于 P1 启动子上游的一个新外显子处。这一短转录产物或许可以解释在其 它研究中也观察到的（58） ，RUNX2mRNA 与蛋白质水平之间的矛盾。在 ENCODE 中该转录 产物被注释为编码蛋白质；但是尚不清楚其任何功能作用。尽管预测它是编码蛋白质的， 在转录产物与蛋白质丰富程度有矛盾的观察基础上，有一点可以推敲的是这种转录产物有 潜在的，独立于翻译的功能，很有可能涉及到一种 RNA 介导的调控机制，这种调控机制可 以影响到来自 RUNX2 位点或其它基因的转录产物。值得注意的是，我们也发现了骨肉瘤中 这种短转录产物的表达（Lorenz et al.,数据未发表） 。 已知 RUNX2 是一种成骨过程中增殖和分化的调控因子（16 ，17） 。我们揭示了数百种 与这一过程相关的 RUNX2 新目标基因（Supporting Information Table S7A） ；因此我们的数 据强烈支持之前的发现，并帮助阐明了涉及执行成骨方向分化过程中这些方面的基因调控 网络。RUNX2 目标基因也与细胞形成组织有关，包括调控肌动蛋白细胞骨架，微管，以及 局部黏附，还有迁移与凋亡（Supporting Information Table S7A） ，提示 RUNX2 涉及分化期 间对这些过程的调控（19，59） ，可能也可以阐述 RUNX2 在癌症中，以及在特定代谢过程 中失调造成的肿瘤生成作用（27） 。 之前两项研究已经报导了癌症环境下，RUNX2 结合位点在基因组范围上的分布情况。 首先, 对前列腺癌细胞系中过度表达且受到标记的 RUNX2，做 ChIP-Seq 表明其主要结合在内 含子区域及基因间区域，结合在基因启动子处的频率低，但是，它结合的启动子对应的目 标基因跟分泌功能有关（60） 。第二项研究识别出了 SAOS-2 骨肉瘤细胞系中 2339 个 RUNX2 目标基因，用的是 ChIP 和启动子微阵列，发现它主要结合在那些跟细胞黏附和运动 性有关的基因上（61） 。虽然用不同的实验流程和分析平台评估了 RUNX2 的结合位点，但 比较这些数据，我们只发现了 243 个共同基因（Supporting Information Table S11） 。总而言 之，这可能指出了由于肿瘤背景环境所致的 RUNX2 结合特异性的转移，这涉及到对其正常 目标基因调控的缺失。 新出现的证据表明 p53 和 RUNX2 之间有调控性相互作用。在来自 p53 无效（null）小 鼠的骨祖细胞中，RUNX2 表达增加（62） ，在 U20S 细胞中发现 RUNX2 蛋白水平受 p53 依 赖性 miRNA mir-34c 作用而下调（30 ） 。此外，人们发现 RUNX2 在 BAX 基因启动子处与 p53 相互作用，下调它的表达，并抑制由 DNA 损伤产生的细胞凋亡（29） 。我们识别出了 154 个基因，它们直接或间接下调 p53 的目标基因，包括那些涉及凋亡和细胞周期调控的基因 （Supporting Information Table S8） ，因此提示 RUNX2 在 p53 调控网络中有广泛的作用。 在我们的分析中，PDGF BB 是另一个预测的 RUNX2 目标基因。PDGF BB 是一种 MSCs 增殖与迁移的调控因子（63） ，有报导说它对成骨方向分化同时具有刺激和抑制作用 （64 ，65） 。就我们所知，没有报导文献将 PDGF 信号途径与 RUNX2 的功能联系起来。我 们关于相当数量的 RUNX2 目标基因是已知的 PDGF 目标基因这一发现，提示 RUNX2 的调控 可能与分化早期的增殖扩张有关。不过，已矿化的细胞中 RUNX2 结合到 PDGF 目标基因上 这一点，提示它在分化晚期起作用。 令人惊讶的是，我们发现 RUNX2 频繁地结合在基因 3末端，或是紧靠其末端的下游， 在许多例子中，其富集的范围非常广（Supporting Information Fig.S9） 。RUNX2 在 5端和 3 端都富集的那些基因，跟细胞运动，发育，TGFB1 以及 PDGF BB 信号途径强烈相关，只有 5端结合的基因与细胞间信号途径有关，只有 3端结合的基因与细胞死亡有关。这可能提 示不同的上游调控途径影响 RUNX2 与目标基因的结合方式。此外，RUNX2 在活化组蛋白标 志物缺失的情况下更多地结合在 3端而不是 5端，提示 3端的结合发生在不同的背景环境 下。以前的文献描述过其