抗p-21 激活的磷酸化蛋白激酶5 多克隆抗体的制备及其在牙胚细胞研究中的应用

抗 P-21 激活的磷酸化蛋白激酶 5 多克隆抗体的制 备及其在牙胚细胞研究中的应用 作者：安政雯 1,2；刘宏伟 1,3；贾志敏 4；李照峰 1；Staffan Str 觟 mblad2；张宏权 2 (南方医科大学 1南方医院口腔科， 4药学院，广东 广州 510515；2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Sweden Huddinge SE- 141 57； 3同济大学附属口腔医学院，上海 200072) 摘要：目的 克隆 PAK5-N 端基因并诱导其表达，进行多克隆抗体制备， 为研究其在牙胚细胞中的生物学功能奠定基础。方法 根据人全长 PAK5 cDNA 序列，设计引物；利用 PCR 技术，以 PAK5 全长 cDNA 为模板扩增 PAK5-N 端基因，将扩增产物克隆至 pGEX-4T-1 载体中，经 EcoRI /XhoI 双酶切后进行重组质粒鉴定，DNA 测序。以硫代半乳糖苷诱导其在大肠杆 菌 BL21 中表达。利用 GST 融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化，通过免疫家 兔制备多克隆抗体，并在牙胚细胞中进行了初步研究。结果和结论 成功 克隆了 PAK5-N 端基因，在 E.coli 中表达了 PAK5-NT，并纯化了 GST 融合 蛋白，制备了 PAK5 特异性抗体。Western blotting 表明 PAK5 在牙胚细 胞中过度表达，为其在口腔细胞中的生物学功能研究提供了依据。 关键词：PAK5；基因克隆；蛋白表达；多克隆抗体；牙胚细胞 中图分类号：R392.4 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2006)06- 0730-04 Preparation of anti-P21-activated kinase 5 polyclonal antibody and its application in dental germ cells AN Zheng-wen1,2； LIU Hong-wei 1,3； JIA Zhi-min 4； LI Zhao-feng 1； Staffan Str 觟 mblad2； ZHANG Hong-quan 2 Department of Stomatology, Nanfang Hospital1, College of Pharmacy4, Southern Medical University, Guangzhou 510515，China; 2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Huddinge SE-141 57, Sweden; 3Affiliated Dental School of Tongji University, Shanghai 200072, China Abstract: Objective To clone PAK5-N terminal sequence for expression in E.coli to prepare its polyclonal antibody, and examine the role of PAK5 in dental germ cells. Methods Based on human PAK5 cDNA sequence, PCR primers were designed to amplify PAK5-N terminal sequence. The PCR product was cloned into the expression vector pGEX-4T-1 EcoRI/XhoI sites, and the recombinant plasmids were identified by agarose gel electrophoresis followed by DNA sequence analysis. The recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21 and the expression of GST-fusion protein was induced by IPTG. Glutathione-Sepharose beads were used to purify GST-fusion PAK5- N-terminal fragment. Anti-PAK5 polyclonal antibody was obtained in immunizing rabbits with purified GST-PAK5 N-terminal fusion protein, and the antibodies were purified by protein A beads and used for detection of PAK5 expression in dental germ cells. Results and Conclusions We successfully cloned PAK5-N terminal gene fragment, and achieved protein expression, purification and production of PAK5-NT polyclonal antibody. The results of Western blotting indicated that PAK5 can be highly expressed in the dental germ cells, suggesting that PAK5 may play an important role in biological function of dental germ cells. Key words: PAK5-N terminal; gene cloning; protein expression; polyclonal antibodies; dental germ cells 收稿日期：2005-09-12 基金项目：瑞典医学会(17450)；瑞典癌症基金会(050373) Supported by Swedish Medical Society(17450) and Swedish Cancer Foundation(050373) 作者简介：安政雯(1973-)，女，在读硕士研究生，主治医师，E-mail: Zhengwen.Anbiosci.ki.se 通讯作者：张宏权，电话：0046-8-6089267，传真：0046-8-6081501，E- mail: Hongquan.Zhangbiosci.ki.se；刘宏伟，电话 8121，传真E-mail: hongwei_ P21 激活的磷酸化蛋白激酶 (PAKs) 作为 Rho 家族中小 GTP 酶，Rac 和 Cdc42 下游的效应因子以及 MAPK 信号通路上游的调控元件，包括 2 个 亚家族(PAKI 和 PAKII)，6 个家族成员(PAK1-6)12。PAKs 在调节细 胞生长、增殖、分化、基因调节，细胞骨架重排以及细胞调亡等过程中起 到重要作用3。PAK5 是一种最近被证实而且很少被了解的 p21 激活的磷 酸化蛋白激酶家族成员之一，属于第二组 PAK 亚家族4。研究表明蛋白 激酶在口腔细胞中参与重要的功能调节，如参与牙周膜细胞的成骨分化， 牙槽骨代谢通路的调节以及在放线伴放线杆菌感染的牙周炎时参与口腔上 皮细胞调亡的调控等567。本实验构建了 pGEX-4T-1-PAK5-NT 表达 载体，转化 E.coli BL21 受体菌，诱导其表达并制备多克隆抗体，初步 鉴定了 PAK5 在牙胚细胞中高表达，为进一步研究 PAK5 在口腔细胞中的生 物学作用提供了重要的研究基础。 1 材料和方法 1.1 主要仪器 PCR 仪(Santa Cruz Biotechnology)；凝胶图像分析仪(Bio-RAD)； 超声裂解仪(Sonic Lanes 1-4: Amplified PAK5-NT 2.2 重组质粒的鉴定 pGEX-4T-1-PAK5-NT 重组质粒经 EcoRI/XhoI 双酶切后用 1.5%琼脂糖 凝胶电泳，可见两条特异性条带，大小分别约为 4900 和 672 bp(图 2)， 与预期大小相符。 2.3 DNA 序列分析 将上述鉴定的阳性克隆扩大培养后，提取质粒进行 DNA 序列分析。图 3 示部分 N 端基因片断的测序结果。经 BLAST 分析，与已知的 PAK5-N 端 蛋白基因序列一致。 图 2 pGEX-4T-1-PAK5-NT 重组质粒的构建与鉴定 Fig.2 Construction and identification of the pGEX-4T- 1-PAK5-NT recombinant plasmids M: DNA marker; Lanes 1-6: The upper bands are the expression vector pGEX-4T-1 after EcoRI/XhoI cleavage and the lower bands are the target gene fragment PAK5-NT 2.4 蛋白表达、纯化及定量 pGEX-4T-1-PAK5-NT 重组质粒转化 E.coli BL21 细菌，经 IPTG 小量 诱导后，产物用 SDS-PAGE 电泳鉴定(图 4)，可见第 3，5，7 行出现特异 性条带，表明 2，3，4 株克隆诱导成功。 对成功诱导的 3 株克隆进行大量培养后，获得 PAK5-NT 的蛋白表达， 经 GST 蛋白纯化系统纯化后，产物 SDS-PAGE 电泳鉴定(图 5)，结果显示 目的蛋白在洗脱液 2 和 3 管中含量最高(第 4，5 行)，在细胞沉淀中含量 最少(第 2 行)。表明我们可以在细胞上清中得到可溶性的目的蛋白。 用标准 GST 蛋白对目的蛋白进行粗略的蛋白定量，结果表明目的蛋白 含量大于 1 mg/ml(图 6)，因此可以用于抗体制备。 图 3 PAK5-NT 基因的序列分析 Fig.3 DNA sequence analysis of the PAK5-NT gene fragment 图 4 经 IPTG 小量诱导后的蛋白表达产物 SDS-PAGE 电泳鉴定 Fig.4 Identification of protein expression by SDS-PAGE after IPTG induction M: Protein marker; Lanes 1,3,5,7: Clones 1-4 induced by IPTG; Lanes 2,4,6,8: Clones 1-4 without IPTG induction 图 5 GST-PAK5 蛋白纯化产物 SDS-PAGE 电泳鉴定 Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GST-PAK5-NT fusion protein M: Protein marker; Lane 1: Flowthrough; Lane 2: Pellet; Lanes 3-6: Elutes of 1-4 EP tubes 图 6 蛋白定量的 SDS-PAGE 电泳分析 Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified PAK5-NT protein quantified by GST standard protein Lanes 1-4: Different amount of GST standard protein as controls; Lanes 5-6: 1 and 2 l of the target protein for quantification compared with GST standard protein 2.5 PAK5 在牙胚细胞中的高表达 比较 PAK5 在牙胚细胞与人类成纤维细胞及其他 3 种神经纤维瘤细胞 中的表达(蛋白上样量为 10 g)，Western blotting 证实 PAK5 在牙胚细 胞中表达最高(图 7)。 图 7 PAK5 抗体鉴定及在不同细胞系中的表达 Fig.7 Identification of PAK5 polyclone antibody and expression of PAK5 in different cell lines DGC: Dental germ cells; BJA: Human fibroblast; CRL2149,CRL2271, HTB11: Human neuroblastoma 3 讨论 P21 激活的 PAKs 是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，可以和 Rho 家族中的 小 GTP 酶，Cdc42 和 Rac 结合，并在某些情况下被激活，调节细胞加工， 例如基因转录，细胞形态、动力和调亡8。1994 年第一个 P21 激活的磷 酸化蛋白激酶，PAK1，作为 Rac 相互作用的蛋白被证实8。随后，其他 PAK 家族成员相继被证实，包括两个亚家族的 6 个成员。这些蛋白激酶结 构保守又非常相似，都含有 N 端的 p21 蛋白结合域(PBD)和 C 端的激酶域 (KD)，只是组织分布不同。根据其保守的结构，PAK1-3 组成 PAK I 亚家 族，而 PAK4-6 构成了 PAK II 亚家族。由于 PAK I 亚家族还含有 N 端的自 体抑制域(AID)，使之区别于 PAK II 亚家族。 由 Dan 等人首次提出在人类基因组中存在 PAK5 基因。PAK5 基因全长 编码序列为 2160 bp，编码 719 个氨基酸。 随后 PAK5 被证实为一种新的 功能性的蛋白激酶，不同与 PAK1-3，在结构上与 PAK4 类似10，属于 PAKII 亚家族。最近研究显示，PAK5 可增加细胞粘附3，并在一些信号 转导通路中发挥作用1112。PAK5 在口腔细胞中的研究尚无报道。 我们期望获得 PAK5 的多克隆抗体，为下一步深入研究提供实验材料， 所以本实验利用基因重组技术成功克隆了 PAK5 N 端基因。 PAK5 N 端基 因序列为 672 bp，编码 224 个氨基酸。为了提高酶切效率，首先将 PCR 扩增产物与 PCR-Blunt 载体连连，然后再用 EcoR I/Xho I 双酶切下目的 基因，从而获得有两个粘端，可以高效连接的基因片断，再将此基因片断 与具有相同酶切位点的表达载体 pGEX-4T-1 连接，琼脂糖凝胶电泳及 DAN 测序表明所克隆的基因正确。曾选用多种 E.coli 菌株诱导蛋白表达，实 验证明在 BL21 中表达最好，而在 TB 菌株中却表达很弱。在蛋白表达过程 中， IPTG 诱导剂加入之前，应监测细菌的 D()值。当 D()值在 0.51 之间时，细菌生长呈对数增长，此时加入 IPTG，在 37 诱导 3 h，可以获得高表达的可溶性目的蛋白。在 IPTG 诱导表达时，适宜的温度 很重要，低温时易得到可溶性的蛋白，但表达量可能会降低。当温度升高 时，可能会增加表达量，同时也易形成不溶性的包涵体，则很难进行蛋白 的纯化。本实验曾试图在室温下进行诱导，但未能成功，而在 37 ，短 时间诱导，得到了高表达的可溶性蛋白，说明此实验条件为适宜条件。我 们选用 GST-融合蛋白纯化系统进行蛋白纯化，可以得到高产量的 GST- PAK5 融合蛋白，最后通过免疫家兔获得了多克隆抗体，并初步证实 PAK5 在牙胚细胞中高表达，使进一步认识和研究 PAK5 在口腔细胞中的生物学 功能成为可能。尽管目前有一种编号为#B50226 的抗 PAK5 多克隆抗体出 现，用于 Western blot 检测时，该抗体的使用浓度为 1500 倍稀释，但 本实验制备的抗体，在同样条件下，使用浓度可以达到 11000 倍稀释， 效价更高，特异性更强，而且本抗体还可以用于免疫荧光和免疫组织化学 研究(结果未示)。故该抗体不仅可以用于口腔细胞的生物学研究，为其他 学科相关细胞的研究也提供了宝贵的实验材料。 (责任编辑：陈望忠) 参考文献： 1Hofmann C, Shepelev M, Chernoff J. The genetics of PakJ. J Cell Sci, 2004, 117(Pt 19): 4343-54. 2Pandey A, Dan I, Kristiansen TZ, et al. Cloning and characterization of PAK5, a novel member of mammalian p21- activated kinase-II subfamily that is predominantly expressed in brainJ. Oncogene, 2002, 21(24): 3939-48. 3Faure S, Cau J, de Santa Barbara P, et al. Xenopus p21- activated kinase 5 regulates blastomeres adhesive properties during convergent extension movementsJ. Dev Biol, 2005, 277(2): 472-92. 4Ching YP, Leong VY, Wong CM, et al. Identification of an autoinhibitory domain of p21-activated protein kinase 5J. J Biol Chem, 2003, 278(36): 33621-4. 5Kawarizadeh A, Bourauel C, Gotz W, et al. Early responses of periodontal ligament cells to mechanical stimulus in vivoJ. J Dent Res, 2005, 84(10): 902-6. 6Hagel-Bradway S, Dziak R. Regulation of bone cell metabolismJ. J Oral Pathol Med, 1989, 18(6): 344-51. 7Kato S, Sugimura N, Nakashima K, et al. Actinobacillus actino- mycetemcomitans induces apoptosis in human monocytic THP-1 cellsJ. J Med Mi