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免疫球蛋白 1 抗体（ antibody， Ab)： B细胞在 Ag刺激下，产生 能与相应 Ag发生特异性结合的免疫球蛋白。 免疫球蛋白（ Immunoglobulin,Ig）： 具有抗体活 性或化学结构与抗体相似的球蛋白。 Ab和 Ig具有不同之处 Ab是 Ig，但 Ig不一定是 Ab 免疫球蛋白可分为分泌型 (secreted Ig， SIg)和膜 型 (membrane Ig， mIg)。 Ab介导的免疫称为体液免疫。 抗体和免疫球蛋白 2 Emil von Behring (1845- 1917) 1901, antitoxins antibody 是介导体液免疫的重要 效应分子，是 B细胞接受 抗原刺激后增殖分化为 浆细胞所产生的球蛋白 。 3 4 一、免疫球蛋白的基本结构 n 四条肽链结构 n Ig的基本结构是 四条肽链的对称 结构 2H+2L=Ig单体 5 一、免疫球蛋白的基本结构n 重 链 ： 免疫球蛋白重链分子量约为 50 75kDa ，由 450 550个氨基酸残基组成，并结合有不 同糖基，因此免疫球蛋白属糖蛋白。 n H链 ： 、 、 、 、 IgM IgG IgA IgD IgE 6 不同类的免疫球蛋白，其链内和链间二硫键的数目和位置、连 接寡糖的数量、结构域的数目及铰链区的长度等均不完全相同 7 一、免疫球蛋白的基本结构 n 轻链： 免疫球蛋白轻链分子量约为 25kDa ，由 214个氨基酸残基组成。 n 根据轻链结构和抗原性的不同分为 (kappa)链和 (lambda)链，免疫球蛋白 因此分为两型 (type)，即 型和 型。 n 各类免疫球蛋白轻链均有 型和 型，两 型轻链的功能无差异。正常人血清免疫 球蛋白的 型 : 型约为 2:1，在小鼠则为 20:1。 8 一、免疫球蛋白的基本结构n 可变区和恒定区 n 可变区 （ Variable Region， V区）：位于 Ig分 子 N端，占轻链 1/2和重链 1/4或 1/5；不同抗体 其 IgV区氨基酸组成和排列有较大差异，并决 定抗体与抗原结合的特异性； 9 10 一、免疫球蛋白的基本结构 n 可变区和恒定区 n 高变区 （ hypervariable region, HVR），或称 互 补性决定区 （ complementarity-determining region， CDR） : VH和 VL可变区内各有 3个区域的 氨基酸组成和排列顺序变化特别大，共同组成一 个与抗原决定基互补的表面，即抗原结合部位。 用 HVR1-3或 CDR1-3表示。 独特型决定簇 ： 与特异性抗原结合的部位。 n 骨架区 （ Framework region, FR） 11 12 一、免疫球蛋白的基本结构n 可变区和恒定区 n 恒定区（ Constant Region， C区） :位于 Ig 分子的 C端，占轻链 1/2和重链 3/4（ IgA、 IgD）或 4/5（ IgM、 IgE）。在同一种属中 ，同一类重链和同一类轻链 C区氨基酸的组 成或排列比较恒定。介导 Ig多种生物学功能 。 n 重链和轻链的 C区分别称为 CH和 CL，不同 型免疫球蛋白的 CL长度基本一致，但不同 类免疫球蛋白的 CH长度不尽相同，可从 CH1 CH3或 CH1 CH4。 13 14 15 一、免疫球蛋白的基本结构n 铰链区 CH1和 CH2之间 , 由 30个氨基酸组成的富 含脯氨酸的结构称为铰链区。 功能：（ 1）利于 Ig CDR与 Ag决定簇吻 合；（ 2）与 Ag结合后， “T”转变为 “Y”型 ，补体结合点暴露 16 二、免疫球蛋白的功能区 n 结 构域： Ig的多 肽链 分子中 约 110个氨 基酸可折叠成由 链 内二硫 键连 接的具有 特定功能的球形 结 构。称 为 免疫球蛋白 的功能区或 结 构域 （ domain） 。 17 VL和 VH: 抗原 结 合部位 CL和 CH1:同种异型的 遗传标记 所在 处 CH2和 CH3： IgG的 CH2和 IgM的 CH3: 补 体 C1q结 合点 ； 母体的 IgG借助 CH2通 过 胎 盘进 入胎儿体 内 CH3、 CH4: 与 细 胞 Fc受体 结 合的部位 IgG的 CH3可 结 合 细 胞表面的 FcR， IgE的 CH2和 CH3可与肥大 细 胞和嗜碱性粒 细 胞的 IgE Fc受体 结 合。 18 19 三、免疫球蛋白的其他成分n J链： 由浆细胞合成、富含 Cys的多肽链，连接 Ig 单体形成多聚体，如 IgA二聚体和 IgM五聚体的形 成。 n 分泌片（ SP）： 由粘膜上皮细胞产生的含糖肽链 ，为分泌型 IgA的辅助成分，可以非共价形式结合 到 IgA二聚体上，并一起分泌到粘膜表面。作用机 理：保护铰链区的酶解，介导二聚体的跨膜转运 。 20 21 SIgA参与黏膜局部免疫 22 23 四、免疫球蛋白的酶解片段 n 木瓜蛋白酶 2 Fab 结合 Ag 1 Fc 可结晶，保留 Ag性及相应功能区的 功能 n 胃蛋白酶 1 F(Ab)2 结合 Ag，双价 pFc 无活性碎片 n 意义： 免疫球蛋白酶解片段的研究不仅对阐 明免疫球蛋白的结构和生物活性十分重要， 而且对生物制品的应用也有重要意义。如白 喉抗毒素、破伤风抗毒素经胃蛋白酶酶解后 精制提纯的制品，因去掉 Fc段而减少超敏 反应的发生。 24 25 四、免疫球蛋白的抗原性或异 质性 n 免疫球蛋白异质性表现为：不同抗原表 位刺激所产生的抗体分子，其结合抗原 的特异性不同；同一抗原表位刺激所产 生的抗体分子，其结合抗原的特异性相 同；但恒定区不同。 n 抗体可变区的异质性 n 抗体恒定区的异质性：类、亚类、型、 亚型 n 外源因素引起的异质性 Ig的多样性 n 内源因素引起的异质性 Ig的血清型 同种型、同种异型、独特型 26 免疫球蛋白的抗原性n 同种型 (isotype)： 是同一种属所有个体的免 疫球蛋白分子所共有的抗原特异性。 n 同种异型 (allotype)： 是同一种属的不同个体 间的免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原 特异性。 n 独特型： 同一个体内的免疫球蛋白分子可 变区的抗原特异性各不相同，其超变区各 自具备独特的抗原表位结构，称为抗体的 独特型 (idiotype, Id)。 27 28 四、免疫球蛋白的抗原性 n 抗独特型抗体：独特型可刺激异种 、同种异体以及自体产生的抗体为 抗独特型抗体（ Anti-idiotype antibody, AId） n 意义：独特型 -抗独特型网络机体免 疫调节的主要方式之一。 29 五、各类 Ig的特点 30 单 体 结 构 含量高，占血清 Ig总 量的 75-80，其中 IgG1含 量最多 半衰期 约 最 长 ： 20-23天，再次免疫 应 答 产 生的 主要抗体，其 亲 和力高，分布广 中和毒素、 调 理吞噬、激活 补 体，是抗感染的 主要抗体 唯一能通 过 胎 盘 的 Ig（ IgG13） 新生儿抗 感染免疫 能与葡萄球菌胞壁上的 A蛋白 (SPA)结 合 纯 化抗体、免疫 诊 断 IgG 31 32 IgM五聚体 单 体：膜 结 合型 构成 BCR 五聚体：分泌型 巨球蛋白 IgM分子量大，不易透出血管， 对 防止菌血症、 败 血症的 发 生具有 强 大的作用。 有 较 多 结 合价，是高效能的抗体，其 杀 菌、溶菌、 溶血、促吞噬以及凝集作用比 IgG高 500倍 1000倍 。 产 生最早（个体 发 育中最早合成，初次体液免疫 应 答中最早 产 生） ,半衰期 较 短 (5天左右 ) ，故 IgM既是 宫 内感染的指 标 ，又是 传 染病早期 诊 断的指 标 。 33 IgA 1、血清型 IgA 占血清 Ig总 量的 10 15 2、分泌型 IgA（ SIgA） 结 构 : J链连 接的双体和分泌片 分布 : 胃 肠 道和支气管分泌液、乳汁（初乳中含量 最高）、唾液、泪液中 功能 : 对 机体的局部粘膜 (如呼吸道、消化道粘膜 ) 的抗感染免疫有重要作用。 新生儿通 过 母乳喂养，可 获 得被 动 免疫。 34 35 IgD 单 体 结 构； 血清含量低，占 Ig总 量的 0.2；半衰期极短， 仅 3天（ 铰链 区 长 ） B细 胞表面的 IgD（ SmIgD）是成熟 B细 胞的重 要表面 标 志：未成熟 B细 胞 仅 表达 mIgM，成熟 B细 胞（初始型）表达 mIgM和 mIgD，活化或 记忆 性 B细 胞 mIgD逐 渐 消失。 36 单 体 结 构 含量最低， 约 占 Ig总 量的 0.002% 黏膜下淋巴 组织 中的 浆细 胞 产 生 与 I型超敏反 应 密切相关 FcRI 为 高 亲 和 力受体，主要分布在肥大 细 胞和嗜碱性粒 细 胞膜上。 IgE 37 六、免疫球蛋白的生物学功能 n 特异性结合抗原 n 激活补体 n 结合细胞 n 通过胎盘和黏膜 n 具有抗原性 38 六、免疫球蛋白的生物学功能 39 V区功能 Ig通过 V区识别并特异性结合抗原，发挥免疫效应 。 结合抗原的效价 IgG、 IgE、 IgD：双价 IgA： 4价 IgM：理论上 10价，实际上 5价。 介导免疫效应：中和毒素，阻止病原体感染、作 为抗原受体识别抗原等。 40 C区的功能 1、激活补体 IgG13、 IgM 经典途径 IgA、 IgE、 IgG4聚合物 旁路途径 2、结合细胞表面的 Fc受体（ FcR） 调理作用：指抗体、补体促进吞噬细胞吞噬细 菌等颗粒性抗原的作用。 如 IgG与巨噬细胞、中性粒细胞 41 发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 (antibody dependent cell-mdeiated cytotoxicity, ADCC)：指具有杀伤活性的细胞如 NK细胞通过 其表面表达的 Fc受体识别结合于靶抗原（如病 毒感染细胞或肿瘤细胞）上的抗体 Fc段，直接 杀伤靶细胞。 NK细胞是介导 ADCC的主要细胞。抗体与抗原 的结合是特异性的，而 ADCC杀伤作用是非特 异性的。 介导 I型超敏反应： IgE 42 43 3、穿过胎盘和粘膜： IgG是唯一能穿过人胎盘 屏障的免疫球蛋白，对新生儿的免疫具有重要 作用。 IgG 通过结合母体侧滋养层细胞表面的 FcRn，主动转移到胎儿血循环。 分泌型 IgA与粘膜免疫 44 45 n Ig基因由三组不连锁的基因群控制 ，即 轻链基因群（ 2号）、 轻链基 因群（ 22号）和重链基因群（ 14号 ） n 基因重排（ gene rearrangement） 在 B细胞发育过程中，一部分基因片 段互相接近，重新排列，形成功能 性的 Ig基因单位的过程。 七、免疫球蛋白基因 46 七、免疫球蛋白基因 肽链 染色体定位 V D J C 22号 长 臂 60(30 ) 0 4 7(4) 2号短臂 90(40 ) 0 5 1 H 14号 长 臂 95(65 ) 27 9(6) 11(9) 表：人胚系基因中 Ig基因定位与片段 注：括号中 为 除假基因及无效基因之外的功能基因片段数 47 48 49 基因重排 n V/D/J/C基因群中各选择一个片段，组成 单个 Ig的编码基因，再转录翻译成功能性 Ig。 n Ig基因重排：胚系 B细胞 VH基因 (D-J V-DJ)重排 轻链基因 (V/J)重排（先是 k，重组失 败， 基因重排） VDJ或 VJ基因 与 C基因连接，形 成 mRNA 翻译为重链和轻链 以二硫键组合成 Ig 七、免疫球蛋白基因 50 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987 “for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity“ Susumu Tonegawa（利川根进） 51 七、免疫球蛋白基因 52 七、免疫球蛋白基因：基 因重排 n 重组信号序列 (recombination signal sequence， RSS)是由寡核苷酸组成的七聚 体 (heptamer) 5CACAGTG3、九聚体 (nonamer) 5ACAAAAACC3，以及两者 之间较少保守性的间隔序列 (spacer)所组成 。 n 间隔序列的碱基数为 12或 23，在重组酶的 识别和作用下，带有 12bp间隔序列的 RSS基 因片段只能和带有 23bp间隔序列的基因片 段结合，保证了基因片段的正确连接，该 现象称为 “12-23规则 ”。 53 七、免疫球蛋白基因 Ig的基因重排信号序列 54 七、免疫球蛋白基因：基 因重排 n 重组酶 (recombinase)是一组参与 V、 (D)、 J基因片 段重组的酶。 n 重组激活基因 (recombination activating gene， RAG) 编码重组激活酶，有 RAG-1和 RAG-2两种，形成的 复合物是一种内切酶，可特异性识别并切除 V、 (D)、 J基因片段两侧 RSS的保守序列。 n 末端脱氧核苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT)表达于 B细胞前体，可将数个核 苷酸（ N-核苷酸）通过一种非模板编码 (non- template encoded)的方式加到 DNA的断端。 n 其他 还有切开发夹结构的内切酶，参与修复 DNA 双链断端的 DNA外切酶、 DNA合成酶等。 55 七、免疫球蛋白基因：基因重排 56 VDJ 基因重组的结果：促进免疫球蛋白基 因的转录 57 七、免疫球蛋白基因： 类别转换 缺失模型 RNA 的可变剪接 58 七、免疫球蛋白基因 59 七、免疫球蛋白基因 n膜表面 Ig（ SmIg）和分泌型 Ig的基因 重排 nSmIg和分泌性 Ig的 H链结构相类似，所 不同的是 SmIg的羧基端多含一段穿膜的 疏水性氨基酸残基和胞浆区。因此 SmIgH链的转录本（ transcript）要比分 泌性 IgH链转录本多 1 2个外显子。 n膜型和分泌型 Ig重链基因的结构和重排 相同，但在 RNA水平上的剪接有所不同 。 60 七、免疫球蛋白基因 n 等位基因排斥现象：早期成熟 B细胞只表达 Ig两个等位基因中的一个。 n 轻链同种型排斥：每个 B细胞合成两型轻链 中的一种。 61 62 Ig 多样性的机制 * 组合多样性 * 连接多样性 * 体细胞高频突变（ B细胞） 63 1. 组 合多 样 性： V/D/J/ 的 组 合及 轻 重 链 的 组 合 肽链 组 合多 样 性 连 接多 样 性 VH VH65 x DH30 x JH6=11700 V V50 x J5 =250 V V30 x J4 = 120 L 250+120 = 370 H+L 2.5 x 108 3 x 107 总计 1014 64 组合多样性 65 2. 连接多样性：发生于胚系基因 CDR3区位于 V/J或 V/D/J片段连接处，两 个片段之间的连接点不同或丢失或插入数个 核苷酸及倒转。 3. 体细胞高频突变造成的多样性： 成熟 B细胞在受到抗原刺激后，在生发中 心发生体细胞高频突变，多发生在 Ig的 CDR 区，若干核苷酸替换突变，利于提高抗体与 抗原的亲和力。 66 七、免疫球蛋白基因 n免疫球蛋白的多样性 连接多样性 : P-核苷酸插入 N-核苷酸插入 67 Junctional diversity 68 Junctional diversity 69 70 八、人工制备抗体 n 多克隆抗体（ polyclonal antibody） n 单克隆抗体（ monoclonal antibody） n 基因工程抗体（ gene engineering Ab） 71 八、人工制备抗体 n 多克隆抗体（ polyclonal antibody） n 用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物， 刺激多个 B细胞克隆所获得的免疫血清（含 多种抗体的混合物），此为多克隆抗体。 n 来源广泛，制备容易；特异性不高， 易产生 交叉反应 72 带 有多个表位 抗原 针对 不同表位 的 B细 胞 克隆增殖 多种抗体的混合物 （多克隆抗体） 刺激小鼠 73 八、人工制备抗体 n 单克隆抗体 n 单个 B细胞克隆增殖产生的只针对某一特 定抗原决定基的抗体称为单克隆抗体（ monoclonal antibody， mAb），单克隆 抗体通过杂交瘤技术制备 n 所制备的高度均一（属同一类、亚类、 型别），单一特异性（仅针对特定抗 原 表位）的抗体，可大量生产。 n 鼠源单克隆抗体可诱导人体产生人抗鼠 抗体 74 Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody 75 HAT: 次黄嘌呤 (H),氨基喋呤 (A)和胸腺嘧啶核苷 (T) HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶 76 八、人工制备抗体 n 基因工程抗体 借助 DNA重组技术和蛋白质工程技术， 按人们的意愿在基因水平上对 Ig进行切 割、拼接或修饰，重新组装成为新型抗 体分子 . 77 八、人工制备抗体 n 基因工程抗体 嵌合抗体 (chimeric Ab) 小鼠 V区基因 + 人 C区基因 载体 表达 人源化抗体 (humanized Ab)即 CDR移植抗体 (CDR-grafted Ab) 小鼠 CDR基因 人 V区框架 78 79 80 八、人工制备抗体 n 小分子抗体 由 Fab和 Fv组成的抗体片段，包括 Fab单 域抗体（ VH或 VL）， Fv（ VH和 CH1） ，单链抗体（ VH-Linker-VL ） 81 分别构建载体 L链表达载体 H链表达载体 共转染细胞 Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的 Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备 ds-Fv 82 VH VL 接头 DNA (Gly4Ser)3 VH引物 PCR VH 接头 DNA 酶切、克隆 ScFv (single chain Fv,scFv )的构建 变性、复性 VL引物 Sc-Fv VL 83 双特异性抗体 抗原 A 抗原