ENO1基因在鼻咽癌发病中的作用研究(病理学与病理生理学论文） .pdf

龙孝斌副教授 20 11 年 月 日 广州 硕士学位论文 e n o 1 基因在鼻咽癌发病中作用的 初步研究 硕士研究生：程超 指导教师：李欣 摘要 研究背景和目的： 鼻咽癌好发于中国南方，特别是广东省，发病率最高因此又被称为“广东 瘤”，是一种具有地域性和家族聚集性的高度恶性肿瘤。鼻咽癌的发生是一个多 阶段、多途径、多机制的过程。流行病学调查显示，鼻咽癌的发生涉及到遗传 倾向性和环境致癌因素，很可能是遗传易感性个体，接受了致癌物的作用而发 生的。其中包括各种环境凶素、e b v 感染和遗传及表遗传学的改变导致瘤基因 过表达及抑瘤基因表达下调或缺失，经过癌前病变，最终发生鼻咽癌。 肿瘤的生成涉及多种基因和基因以外的变化，任何单独一种基因的改变不 足以致瘤，多种基因变化的积累才能引起控制细胞生长和分化的机制紊乱，使 细胞的生长失控而瘤变。在这些基因的变化中，最常发生两类基因的异常变化， 即瘤基因及肿瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同样涉及多基因的表达改变。在过去 几十年中，虽然我们对于鼻咽癌发生的分子基础认识已经有了很大的提高，但 这些认识还是远远不能完全揭示鼻咽癌的发病机理。因此，鼻咽癌相关新基因 的发现和研究仍将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。 e n o l a s e i 基因的表达随细胞病理生理、代谢、发育状况的不同而改变，其主 一要编码两种蛋白。多数情况下，q e n o l a s e ( 即e n 0 1 ) 是烯醇化酶家族中3 种同 功酶之一，是一个高度保守的胞浆糖酵解酶，既可催化糖酵解过程中2 磷酸阻 甘油酸( p c a ) f 司磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 的转化，又可在糖原合成过程中，催化 逆向反应，即作为磷酸丙酮酸水合酶，使p e p 向p g a 转化，在细胞能量代谢过程中 中文摘要 起重要的作用。另一种称为c m y c 启动子结合蛋白( m b p - - 1 ) ，不具有酶活性， 可表达于细胞核，与核d n ac m y c 启动子结合，负向调控c - m y c 的表达。c - m y c 基因是一种细胞核内癌基因，它编码的核内转化蛋 刍p 6 2 对正常细胞生长和分化 起重要调节作用。c m y c 表达活性与细胞生长分裂关系密切，据认为它是诱导 增殖和凋亡双重作用的基因。正常情况下c m y c 基因不显示转录活性或低水平 表达。c m y c 基因被激活后可致其产物p 6 2 过度表达而堆积在细胞内，使细胞 获得永生。近年来多项研究表明c m y c 基因在肿瘤的发生发展中起重要作用，其 在肿瘤组织中的表达率与患者的生存期呈显著相关。这也提示e n 0 1 除了作为糖 酵解反应的限速酶外，还参与细胞的其他生物学活动。 在早期对e n o i 研究中发现，e n o i 能够抑制肿瘤细胞的生长。但有趣的 是，与前述e n 0 1 抑制肿瘤细胞增生的作用截然不同，近年来越来越多的研究表 明，e n o i 在肿瘤发生及发展中所发挥的作用并非如早年研究所指出的，是一个 具有潜在抑癌能力的基因。与之相反，近年来的研究结果不断表明，e n o i 很 可能是一个在肿瘤生发发展和转移等多个环节过程中均发挥作用的重要癌基 因。目前提出e n o i 可能具有癌基因功能的多项研究主要集中在肝癌、t h , 细 胞肺癌、甲状腺嗜酸细胞瘤以及黑色素细胞瘤等肿瘤上。通过蛋白质组学， w e s t e mb l o t 和免疫组化等技术发现，e n 0 1 在这些肿瘤的细胞系、活体组织中 有较高水平表达。并且，多篇文献指出，在多种肿瘤患者的外周血中，检测出 的e n o i 自身抗体的水平与该类肿瘤的分化、分期及预后显示出明显的正相关 关系。在对e n o i 促进肿瘤细胞生长机制的探讨中，大多数认为e n 0 1 在肿瘤 细胞生长过程中的能量代谢过程中起到积极作用，尤其是大多数肿瘤在高代谢 情况下，其生长对于糖酵解作用获能的依赖成为目前研究的重点。在增殖较快 的肿瘤细胞中，e n o i 有相对高水平的表达：而在非增殖的角质化细胞中， e n 0 1 的合成明显减少。由于糖酵解过程的变化与细胞增殖有关，故推测，在肿 瘤细胞增殖过程中，e n 0 1 的表达可以通过影响糖酵解，三羧酸循环，以及随 后的氧化磷酸化酶作用物的水平，进而影响a t p 的合成，这对肿瘤细胞的生长 硕士学位论文 十分重要。 但目前有关e n o i 在鼻咽癌中的作用的研究还未见报道。在本研究所方唯 意等研究中，利用基因芯片技术对8 组n p c 病人标本及对照，两组细胞株进行 了基因筛选，结果显示，在病理标本及细胞株中，e n 0 1 的表达均显著提高。 因此，本课题旨在研究e n o i 在鼻咽癌细胞及组织中的表达特性，并进一步通 过改变e n 0 1 表达水平来观察其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。为进一步明 确鼻咽癌的发病机制奠定良好的基础。 方法： 1 鼻咽癌中e n o i 表达特性的鉴定及临床意义。 利用免疫组化检测1 2 0 例鼻咽癌与4 0 例正常鼻咽中e n 0 1 基因的表达情况。 2 e n o i 表达沉默对鼻咽癌细胞h o n e i 生物学特性的影响。 荧光定量p c r 检测鼻咽癌细胞系( 6 个细胞系，5 8 f ，6 1 0 b ， s u n e i ，c n e 2 ，c n e i ，h o n e l ) 中e n o i 的表达情况，筛选高表达e n 0 1 的细胞株。 设计并体外化学合成针对e n 0 1 基因的小干扰r n a 序列，以脂质体 ( 1 i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 ) 为载体转染鼻咽癌细胞株h o n e i ，采用荧光定量p c r 法测定转染后h o n e i 细胞e n 0 1 及内参g a p d h 的m r n a 表达，测定干扰效率， 以筛选出最有效干扰序列。后将最有效的干扰片段转染至h o n e in p c 细胞。荧 光定量p c r 法检测e n o i 在干扰前后m r n a 的变化。以转染细胞系为样本，利 用t r a n s w e l l 小室实验检测e n 0 1 被沉默后h o n e l 细胞体外迁移运动能力的改 变，利用b o y d e n 小室实验检测e n 0 1 沉默对n p c 细胞的侵袭迁移能力的影 响；m t t 、流式细胞仪检测e n 0 1 表达水平改变后对n p c 细胞增殖、细胞周期分 布、细胞凋亡和停泊非依赖性生长能力的影响。 结果： 1 鼻咽癌中e n 0 1 表达特性的鉴定及临床意义 i l l l 中文摘要 ( 1 ) 免疫组织化学检测e n 0 1 蛋白在鼻咽癌组织中的表达：s p 免疫组化结 果表明，e n o i 表达主要定位在鼻咽癌细胞胞浆中，阳性表达结果在镜下呈棕黄 色。而在慢性鼻咽炎组织及肿瘤周围相对正常组织则为弱阳性或阴性表达。我 们利用e n 0 1 兔抗人多克隆抗体对1 2 0 例鼻咽癌标本和4 0 例正常鼻咽组织进行 了免疫组化检测，e n o i 的高表达率在鼻咽癌组织中为6 0 o ( 7 2 1 2 0 ) ，而在 正常组织中为2 7 5 ( 11 4 0 ) ( 9 2 = 1 1 4 2 4 ，p = 0 0 0 1 ，) 。两组e n o i 的表达具 有显著性差异。而在对临床分期与淋巴结转移、远处转移的分析中，结果显示 e n o i 的表达与临床分期显著相关( x , 2 = 1 3 9 1 9 ，p = 0 0 0 3 ) 。临床t 4 期组要低于 临床t 1 t 3 期组，即e n 0 1 阳性表达者，多为临床早中期；e n 0 1 阴性表达者转 移发生率低，多为临床晚期。但e n 0 1 蛋白蛋白表达与颈淋巴结转移及远处转 移无关( p 0 0 5 ) 。上述实验结果提示我们e n o i 在鼻咽癌表达上调，且与转 移及临床分期显著相关。但其表达上调对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响以及 调控的具体机制仍不明确。 2 e n o i 表达沉默对鼻咽癌细胞c n e 2 生物学特性的影响 ( 1 ) 荧光定量p c r 检测：e n 0 1 在鼻咽癌细胞中的表达采用q p c r 检测 e n o i 基因在鼻咽癌细胞株中的表达情况，结果单因素方差分析显示6 种细胞株 中e n 0 1 的表达差异具有显著性( f = 1 3 0 6 7 ，p = - 0 0 0 0 ) 。其中筛选出h o n e i 为高表达e n o i 的细胞株，作为下一步实验的干扰对象。 ( 2 ) 瞬时转染s i r n a e n 0 1 2 片段入h o n e i 细胞系。采用m t t 法检测 e n o i 基因沉默后细胞的体外增殖情况，结果显示，与h o n e l - n c 和h o n e l 细胞相比，h o n e i s i e n 0 1 细胞的增殖速度显著减慢，并且呈时间依赖关系 ( f = 4 7 6 4 ，p - - 0 0 0 1 ) 。细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布，结果显示两组细 胞的细胞周期分布并无显著性差异。综上所述，e n o i 表达沉默显著抑制了鼻 咽癌细胞的体外增殖能力。 ( 3 ) 瞬时转染s i r n a e n 0 1 - 2 片段入h o n e i 细胞系。采用t r a n s w e l l 小室 检测e n 0 1 基因被沉默后h o n e i 细胞体外迁徙运动能力的变化，结果显示：结 硕士学位论文 果发现两组细胞运动能力的差异具有显著性，忙3 1 6 3 ，p = - 0 0 0 4 ) 。与空载体对 照h o n e n c 细胞相比，干扰e n 0 1 后的h o n e l 细胞穿过膜的细胞数显著增加， 其运动能力明显增强。 b o y d e n 小室检测e n 0 1 基因沉默后h o n e l 细胞体外侵袭运动能力的改变， 结果显示，两组细胞侵袭能力的差异具有显著性( t = 1 3 7 5 8 ，p = - 0 0 0 0 ) ，与 h o n e l - n c 细胞相比，h o n e i s i e n o l 细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数增加， h o n e i s i e n o l 细胞的侵袭能力显著增强。以上结果表明，e n 0 1 基因沉默后显 著提高了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。 结论： l 。较正常鼻咽组织，e n o i 在鼻咽癌组织中表达明显上调，且与鼻咽癌的 侵袭与转移密切相关； 2 e n 0 1 基因沉默后显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖，但促进了迁移和 侵袭能力。e n 0 1 与鼻咽癌的发生发展密切相关； 关键词：鼻咽癌e n o i增殖侵袭转移 v 硕士学位论文 t h e p r i m a r yr e s e a r c ho n t h er o l e so fe n 0 1 g e n e i nt h ep a t h o g e n e s l so tn a s o p h a r y n g e a l -11 -l c a r c l n o m a n a m e ：c h e n gc h a o s u p e r v i s o r ：p r o f l ix i n a b s t r a c t n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a ( n p c ) i so n eo ft h ec o m m o n e s tc a r c i n o m a sw i t ha h i g hd e g r e eo fm a l i g n a n tp h e n o t y p ei ns o u t h e r nc h i n a e s p e c i a l l yt h o s eo fc a n t o n e s e o r i g i n b o t ht h eg e o g r a p h i cp a t t e r na n df a m i l i a la g g r e g a t i o no fi n c i d e n c ea r et w o m a i nc h a r a c t e r i s t i c so fn p c t h ec a r c i n o g e n e s i so fn a s o p h a r y n g e a le p i t h e l i u mi sa m u l t i - s t a g e ，m u l t i p a t ha n dm u l t i - m e c h a n i s mp r o c e s s , w h i c h i si n v o l v e di nt h ee f f e c t s o fs e v e r a lf a c t o r si n c l u d i n gg e n e t i cp r e d i s p o s i t i o n ，e n v i r o n m e n t a lc a r c i n o g e na n d e p s t e i nb a r rv i r u s ( e b v ) t h ec h a n g e so fv a r i o u se n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，e b v i n f e c t i o n ，g e n e t i c sa n de p i g e n e t i c sc a u s et h eo v e r e x p r e s s i o no fo n c o g e n e sa n d d o w n r e g u l a t e do rn u l le x p r e s s i o no f t u m o rs u p p r e s s o r si nn a s o p h a r y n g e a le p i t h e l i u m ， w h i c hw i l ll e a dt ot h et r a n s i t i o no fe p i t h e l i u mt op r e c a n c e r o u sl e s i o n ，a n df i n a l l yb e t r a n s f c r m e dt on p c c a r c i n o g e n e s i si sa s s o c i a t e dw i t ht h ep a r t i c i p a t i o no fe x p r e s s i o na l t e r a t i o no f m u l t i p l eg e n e s t h ee x p r e s s i o nc h a n g eo fa n ys i n g l eg e n ed o e sn o th a v et h ea b i l i t y t o d r i v et h em a l i g n a n tt r a n s f o r m a t i o no f n o r m a le p i t h e l i u m i nt h ep a s tf e wy e a r s ， a l t h o u g ht h ek n o w l e d g eo fm o l e c u l a rm e c h a n i s m sa b o u tn p c h a sg r e a t l yi n e r e a s e d i t sp a t h o g e n e s i sr e m a i n st ob ec l a r i f i e d e n oi g e n ep r i m a r i l ye n c o d e so n eo ft h r e ee n o l a s ei s o e n z y m e sf o u n di n l 一 a b s t r a c t m a m m a l s i ti sa l p h a - e n o l a s e ，a l le n z y m ei nt h eg l y c o l y t i cp a t h w a y , c a t a l y s i n gt h e f o r m a t i o no fp h o s p h o c n o l p y r u v a t ef r o m2 - p h o s p h o g l y - c e r a t e t h i sg e n e a l s o e n c o d e sas h o r t e rm o n o m e r i cs t r u c t u r a ll e n sp r o t e i n ，w a se a r l i e rk n o w na s t h e m y c - b i n d i n gp r o t e i n 一1 ( m b p - 1 ) t h i ss h o r t e rp r o t e i ni sl o c a l i z e dt ot h ec e l ln u c l e i ， a n dh a sb e e nf o u n dt ob i n dt oa ne l e m e n ti f it h ec - m y ep r o m o t e r r e c e n tr e s e a r c h e s s h o wt h a tt h ec - m y cp r o t o o n c o g e n ei sad n a b i n d i n gp h o s p h o p r o t e i nt h a tp l a y sa l l i m p o r t a n tr o l ei n c e l lg r o w t hr e g u l a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n i t se x p r e s s i o nl e v e li s i n d e p e n d e n tp r e d i c t i v ef a c t o rf o r s u v i v e rt i m eo fp a t i e n t sw i t hr u m o r s i nt h ee a r l ys t u d yf o u n dt h a to fe n 0 1 ，e n o ic o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho f t u m o r b u ti ti si n t e r e s t i n gt h a t ，r e c e n tr e s e a r c h e ss h o wt h a te n o ig e n ei sn o t , a se a r l i e r p o i n t e do u t , a nt u m o rs u p p r e s s o rg e n e i nc o n t r a s t , e n o ii sl i k e l yt ob ep l a ya i m p o r t a n tr o l ei np a t h o g e n e s i sa n dp r o g r e s s i o no ft u m o r c u r r e n t l ym a n ys t u d i e s a b o u te n o ig e n ef u n c t i o nf o c u s e do nl i v e rc a n c e r , n o n s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , h u r t h l ec e l lc a n c e r , m e l a n o m aa n do t h e rt u m o r s t h r o u g hp r o t e o m i e s ，w e s t e r nb l o ta n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u e st h a t , e n oii nt h e s et u m o r sc e l ll i n e sa n dt i s s u e h a v eh i i g hl e v e l so fe x p r e s s i o n f u t h e r m o r e ，m a n yp a p e r sn o t e dt h a tt h e r ew a s s i g n i f i c a n tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nl e v e l s o fa u t o a n t i b o d i e se n o ii nt h ep e r i p h e r a l b l o o do fp a t i e n t sw i t hm u l t i p l et u m o r sa n ds u c ht u m o r ss t a g ea n dp r o g n o s i s i nt h e s t u d yo ft h em e c h a n i s mo fe n oi ，m a j o r i t ys t u d i e ss u g g e s tt h a te n o i p l a ya p o s i t i v er o l ei nt h ee n e r g ym e t a b o l i s mo ft u m o rc e l l s , e s p e c i a l l yi nh i g hm e t a b o l i c c a s e s c o m p a r e dw i t hn o n - p r o l i f e r a t i o nc e l ll i n e s ，t h er a p i dp r o l i f e r a t i o nc e l ll i n e s h a v eh i g hl e v e lo fe n o ie x p r e s s i o ns i g n i f i c a n t l y s os p e c u l a t et h a ti nt h ep r o c e s so f c e l lp r o l i f e r a t i o n ，e n oie x p r e s s i o nc a na f f e c tg l y c o l y s i s ，k r e b sc y c l ea n dt h e s u b s e q u e n to x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o ne n z y m es u b s t r a t el e v e l ，t h e r e b ya f f e c t i n gt h e s y n t h e s i so f a t p , w h i c hi si m p o r t a n t a n tf o rt h eg r o w t ho f t u m o r c e l l s b u tt i l ln o wt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ee n o ig e n ea n dn p ch a sn o tb e e n 硕士学位论文 r e p o r t e d i np r o f e s s o rf a n gw e i y ip r e v i o u sw o r k , w eu s e dg e n ec h i pt e c h n o l o g yt o a n a l y s e8g r o u p so f n p cp a t i e n t sa n dc o n t r o ls a m p l e s ，t w oc e l ll i n e s ，r e s u l t ss h o w e d t h a t i np a t h o l o g i c a ls p e c i m e n sa n dc e l ll i n e s ，e n 0 1e x p r e s s i o nw e r es i g n i f i c a n t l y m c r e a s e d b a s e do nt h e s er e s u l t s ，w ew a n tt os t u d yt h a tt h ec h a r a c t e r i s t i c so fe n o ! i nn p cc e l l ，a n df u r t h e rb yc h a n g i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe n o 1t oo b s e r v ei t s b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fn p cc e l l s t of u r t h e rd e f i n et h ep a t h o g e n e s i so f n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m al a yag o o df o u n d a t i o n c o n t e n t sa n dm e t h o d s 1 i d e n t i f i c a t i o no f e x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c so f e n o li nn p ca n di t ss i g n i f i c a n c e t h ee x p r e s s i o no fe n o ip r o t e i ni nn p ct i s s u e sw a sd e t e c t e db yi m m u n e - o h i s t o c h e m i s t r y ( i h c ) 2 e f f e c t so fe n olk n o c k - d o w no nb i o l o g i c a lb e h a v i o r so fh o n elc e l l s t h ee x p r e s s i o no fe n o im r n ai n6n p cc e l l l i n e s ( 5 - 8 f ，6 - 1 0 b ， s u n e l ，c n e 2 ，c n e i ，h o n e i ) w a sd e t e c t e db yq u a n t i t a t i v er e a lt i m e - p c r r e s p e c t i v e l y t h eh i g h e x p r e s s i n ge n 0 1c l o n e sw e r es c r e e n e d s t r u c t u r eo fe n 0 1m r n aw a sa n a l y s e db ys o f t w a r et os e l e c tt a r g e t e di n t e r f e r e n c es i t e s t h r e es i r n aa n do n en e g a t i v ec o n t r o ls i r n aw e r ec o n s t r u c t e da n dc h e m i c a l l ys y n t h e s i z e d ，t h e n b et r a n s f e e t e di n t on p cc e l l l i n ep h o n e1b yp o s i t i v ei o nl i p o s o m el i p o f e e t a m i n e 2 0 0 0 u s e q u a n t i m t i v er e a lt i m e - p c rt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fe n o im r n a ，t h e ne s t i m a t et h e i n t e r f e r e n c ee f f i c i e n y , s c r e e n i n gt h em o s te f f e c t i v es i r n a s p e c i f i c a n t i - e n ois h o r tr n aa n dc o n t r o lv e c t o rw e r ec o n s t r u c t e d r e s p e c t i v e l y ，a n dt h e nw e r et r a n s f e c t e di n t oh o n e ic e l l s q u a n t i t a t i v er e a lt i m ep c r w a su s e dt od e t e c tt h ee f f i c i e n c yo fi n t e r f e r e n e eo fe e l ic l o n e a f t e rt h ei n h i b i t i o no f a b s t r a c t t h ee n d o g e n o u se n 0 1 ，t h eg r o w t h ，c e l lc y c l ea n di n v a s i o no fc e l l sw e r ed e t e c t e db y m nt r a n s w e l l ，f a c sa n db o y d e nc h a m b e ra s s a yi nv i t r or e s p e c t i v e l y 1 迁：s u l t s 1 i d e n t i f i c a t i o no f e x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c so f e n 0 1i nn p ct i s s u e s i na ni m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d y ，e n o1 s t a i n i n gw a sm o s t l yo b s e r v e di nt h e n u c l e u so fc a r c i n o m ac e l l s n os p e c i f i ce n oi s t a i n i n gw a so b s e r v e di nn o r m a l a d j a c e n tn a s o p h a r y n g e a le p i t h e l i a lc e l l sa n ds t r o m ac e l l s i ns u r r o u n d i n gt i s s u e s e n o iw a sf o u n dt oe x p r e s si n6 0 0 ( 7 0 1 2 0 ) c a s e so fn p c ，h i g h e rt h e n2 7 5 ( 11 4 0 ) c a s e so f c h r o n i cn a s o p h a r y n g i t i st i s s u es a m p l e s 货= 11 4 2 4 ，p - - 0 0 0 1 ) t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc l i n i c o p a t h o l o g i c a lf e a t u r e sa n de n o 1e x p r e s s i o ni n n p cw a sa n a l y z e dw i t hp e a r s o nc h i s q u a r et e s t b u tt h e r ew a sn os i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i pb e t w e e ne x p r e s s i o n o fe n o ia n d l y m p hn o d em e t a s t a s i s a n d p o s t r a d i o t h e m p yd i s t a n tm e t a s t a s i s ( p 0 0 5 ) i n t e r e s t i n g l y ，w eo b s e r v e dt h a tt h e p o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo fe n o ! p r o t e i ni ns t a g et i + t 2 + t 3 w a sh i g h e rt h a nt h a to f i np a t i e n t sw i t ht 4 ( = 1 3 9 1 9 ，p = 0 0 0 3 ) 2 e f f e c t so fe n olk n o c k - d o w no nb i o l o g i c a lb e h a v i o r so fh o n e1 q u a n t i t i v er e a l - t i m ep c r w a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fe n 0 1i n6n p c c e l ll i n e s ( 5 - 8 f ，6 - 1 0 b ，s u n e i ，c n e 2 ，c n e l ，h o n e i ) t h er e s u l ts h o w st h a tt h e h o n eil i n ei sah i g h - e x p r s s i n gc l o n e s i r n a - e n o1w a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f e c t e di n t on p cc a n c e rc e l ll i n eh o n e i ， e n o i - s i r n aw e r es u c c e s s f u l l yt r a n s f e c t e di n t oh o n e ia f t e r1 2 hd e t e c t e d b y 硕士学位论文 q p c r ，e n 0 1m r n al e v e l si nh o n e lc e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d ，s i r n a - 2 r e s u l t e di nt h eh i g h e s ti n h i b i t i n gr a t e h o n ei s i r n ac e l l ss h o w e das i g n i f i c a n t l y r e d u c e dp r o l i f e r a t i o nc o m p a r e dw i t hh o n eia n dh o n ei - n cc e l l s 舔d e t e r m i n e db y i nv i t r om t t a s s a y ( f = 4 7 6 4 ，p = - 0 0 01 ) h o w e v e r , t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nd e t e c t e d b yf l o wc y t o m e t r yh a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ne a c ho t h e r t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dk n o c k - d o w no f e n 0 1c o u l dr e d u c ep r o l i f e r a t i o no f h o n e lc e l l s t h er e s u l t so fi nv i t r op r o l i f e r a t i o na s s a ys h o w e dt h a tc o m p a r e dt oa n e g a t i v ec o n t r o l h o n e ic e l l ，t h ep r o l i f e r a t i o na b i l i t yo fh o n e i - 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