硕士论文-迷迭香有效成分的提取与结构研究.pdf

海南大学 硕士学位论文 迷迭香有效成分的提取与结构研究 姓名：陈四利 申请学位级别：硕士 专业：应用化学 指导教师：冯玉红 20090501 海南大学硕士学位论文 摘要 本文在查阅国内外文献的基础上，对迷迭香的资源分布、性状、用途和研究现状作 了综合评价。利用传统的提取方法和现代分析测试手段相结合，对迷迭香精油的化学成 分及其抗氧化性作了初步研究，并对迷迭香醇提物的化学成分进行细致研究。 首先采用传统的水蒸气蒸馏法，提取福建产迷迭香叶中的精油。运用气相色谱质 谱( g c m s ) 联用技术对迷迭香精油的化学成分进行分析研究。按照国标g b 5 0 0 9 3 7 1 9 8 5 的标准方法，以猪油和花生油做底物，测定迷迭香精油作为油脂的抗氧化 剂的效果，结果表明；迷迭香精油作为油脂的抗氧化剂的抗氧化性不是很明显，远没有 t b h q 的效果明显。 采用9 5 乙醇在5 0 - - 一，6 0 。c 的温度下热浸提取迷迭香有效成分，将所得浸膏用蒸馏水 悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，粗分为四个部分后，再对各个部分进行 分离纯化。利用反复正相硅胶柱色谱、s e p h a d e xl h 2 0 凝胶柱色谱、r p 1 8 反相柱色谱 以及重结晶等方法，反复交叉使用，对迷迭香的成分经行了系统的研究。从中分离出了 1 0 个化合物。利用理化性质、波谱学( u v 、i r 、1 h - n m r 、1 3 c - n m r 和2 d - n m r 、m s ) 等方法鉴定了它们的结构，分别是：桦木醇( b e t u l i n ) ( i ) 、迷迭香酚( r o s m a n 0 1 ) ( i i ) 、 表迷迭香酚( e p i r o s m a n 0 1 ) ( ) 、 7 ，2 4 t i r u c a l l a d i e n 3b ，2 7 d i o l ( 1 v ) 、 t i r u c a u a - 7 ，2 4 d i e n 一3 p ，2 1 ，2 3 t r i o l ( v ) 、p 香树酯醇( p a m y r i n ) ( v i ) 、熊果酸( u r s o l i c aa c i d ) ( v i i ) 、桦木酸( b e t u l i n i ca c i d ) ( ) 、迷迭香醌( r o s m a n o lq u i n o n e ) ( i x ) 、芫花素( g e n k w a n i n ) ( x ) 。其中( i i ) 、( i i i ) 为二帖酚类，具有很好的抗氧化性，( i ) 、( v i ) 、( v i i ) 、( ) 为 三萜、甾醇类，( x ) 为黄酮类化合物。7 , 2 4 - t i r u e a l l a d i e n - 3 1 3 ，2 7 d i o l ( i v ) 、 t i r u e a l l a - 7 ，2 4 d i e n 3 p ，2 1 ，2 3 t r i o l ( v ) 是甘遂烷三萜化合物，是本研究工作首次从该植物 中分离得到。 关键词：迷迭香精油化学成分甘遂烷三萜 迷迭香有效成分的提取与结构研究 a bs t r a c t mr e s e a r c ha d v a n c e so i lr o s e m a r yi s r e v i e w e d ，s u c ha se x t r a c t i o na n da n a l y s i s m e t h o d s ，t h ek n o w na c t i v ec o m p o n e n t so fr o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl a n di tu s e di nf i e l d ， c o m m o d i t i e sc h e m i c a li n d u s t r ya n dm e d i c a lg a r ei n d u s t r y i nt h i sp a p e r , t h ee f f e c t i v e c o m p o n e n t sw e r ee x t r a c t e du s i n gt r a d i t i o n a lm e t h o d s c o m b i n i n gm o d e ms e p a r a t i o na n da n a l y s i st e c h n o l o g yf r o mr o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl 刃 e c o m p o n e n t so fe s s e n t i a lo i l a n di t sa n t i o x i d a n ta c t i v 时w e r es t u d i e d t h ec h e m i c a l c o n s t i t u e n t sa n dt h e i rs t r u c t u r e so fe t h a n o le x t r a c tw e r ed e t e r m i n e di nd e t a i l e s s e n t i a lo i lw a se x t r a c t e df r o mt h el e a v e so fr o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl b ys t e a m d i s t i l l a t i o n t h ec h e m i c a lc o m p o n e n t so ft h ee s s e n t i a lo i lw e r ei r r e s t i g a t e db yg c m s a c c o r d i n gt og b5 0 0 9 3 7 - 19 8 5 t h ea n t i o x i d a t i o na c t i v i 锣o fr o s e m a r ye s s e n t i a lo i l si no i l s a n df a t sw a ss t u d i e db ya d d e di ti n t oo i l sa n df a t s ，t h e nm e a s u r e dp o vw h e ni tw a s s t r e n g t h e n e da n dp r e s e r v e d e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea n t i o x i d a t i o no fr o s e m a l y e s s e n t i a lo i l si sn o to b v i o u s n ee s s e n t i a lo i li sn o tg o o df o ru s i n ga sa n t i o x i d a n t si nf o o d o i l sa n df a t s t h el e a v e so fr o s m a r i n u so f f i c i n a l i slw e r ep u l v e r i z e d ，d i p p e di n9 5 e t h a n o la t5 0 - - 6 0 “ c e x t r a c t i o n sw e r ed i s s o l v e di nd i s t i l l e dw a t e ra n de x t r a c t e db y o r g a n i cs o l v e n t s p e t r o l e u me t h e r , e h t y l a c e t a t ea n db u t a n o l r e s p e c t i v e l y t h e ns e p a r a t e dr e s p e c t i v e l y 。，n l e e x t r a c t i o n sw e r ed i s s o l v e da n d s e p a r a t e db y t c la n ds i l l i c ac o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , s e p h a d e xl h 2 0a n dr p - 18c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y i nc o n s e q u e n10 c o m p o u n d sw e r eo b t a i n e df r o mr o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl t h es t r u c t u r e so ft h e s ec o m p o u n d s a r ei d e n t i f i e db yp h y s i c o - c h e m i c a lc o n s t a n t sa n dm o d e mt e s ta n da n a l y s i st e c h n o l o g y 一巩 i g , l h n m r , 1 3 c n m ra n d2 d n m r , m se t c t h e ya l eb e t u l i n ( i ) ，r o s m a n o l ( i i ) ，e p i r o s m a n o l ( i i i ) ，7 ，2 4 - t i r u c a l l a d i e n - 31 3 ，2 7 一d i o l ( ) ， t i r u c a l l a - 7 ，2 4 一d i e n 一3b ，21 ，2 3 一t r i o l ( v ) ，p - a m y r i n ( v 1 ) ，u r s o l i c aa c i d ( v i i ) ，b e t u l i n i ca c i d ( n ) ， r o s m a n o l q u i n o n e ( i x ) ，g e n k w a n i n ( x ) a m o n gt h e s e ( i i ) a n d ( m ) a r ep h e n o l i c d i t e r p e n o i d , s h o wa n t i o x i d a n ta c t i v i t y c o m p o u n d ( i ) ，( ) ，( ) a n d ( v l l l ) a l et r i t e r p e n e ( x ) i sf l a v o n o i d s a n d7 , 2 4 - t i r u c a l l a d i e n 一3 p ，2 7 一d i o l ( ) a n dt i r u c a l l a - 7 ，2 4 一d i e n - 3 1 3 ，2 1 ，2 3 - t r i o l ( v ) a r et i r u c a l l a d i e n 。t h et w oc o m p o u n d sw e r ef i r s t l ye x t r a t e df r o mr o s m a r i n u so f f i c i n a l i s i k e y w o r d s ：r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl ；e s s e n t i a lo i l ；c h e m i c a lc o n s t i t u e n t s ；t i r u c a l l a d i e n 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者躲f 死t 多事)吼砷年乡胁日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：豫q 弘) 导师签名：乡缈 日期：易呻年笤月f 2 ，日 日期：少年月f 2 一日 i， 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。圄重途塞毽塞唇进卮i 旦圭生；旦= 生；旦三生筮查。 导师签名：、泐 导师签名： 彤耖少 日期如7 年占月乙日 、矽日 p 他 酗妇 纷协 签哆粼呷 文期 海南大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 天然药物开发的时代背景 1 1 1 天然药物与医药 天然药物化学是运用科学理论与方法研究天然药物中化学成分的- - i - j 学科【l 】。其研究 内容包括各类天然药物的化学成分( 主要是生理活性成分或药效成分) 的结构特点、物 理化学性质、提取分离方法以及主要类型化学成分的结构鉴定等。天然药物化学是植物 化学、药物化学、生物化学、农业化学的基础，它与生物学、药物学、农艺学等学科密 切相关。它的成果可广泛应用于医药、食品、轻工、化工等领域。中国自然资源丰富， 又有几千年传统防治疾病的经验积累，在中国大力发展天然药物化学的研究有着重要的 现实意义。充分利用开发中国动植物资源包括海洋生物资源和微生物资源，努力发展新 的生理活性物质，为国民经济和人类健康服务是天然药物化学的重要任务。 天然药物是医药的重要组成部分1 2 ，是从植物、动物和微生物等天然资源中开发出 来的药物。药用植物及中药材种类繁多，在中国，天然药物又称为中草药，更具有自己 的特色。早在数千年前我国就有神农氏尝百草的传说。汉代的神农本草经记载了3 6 5 种药物，其中主要是植物药，也有动物药和矿物药：明代李时珍编写的本草纲目共 5 2 卷，收载天然药物达1 8 9 2 种，处方1 2 0 0 0 多条：清代赵学敏又补充了1 0 2 1 种。新版 中药大辞典将收载1 2 8 0 7 种中药材其中药用植物种1 1 1 4 6 种，动物1 5 8 1 种，矿物8 0 种。此外其他民族地区尚有藏药2 2 9 4 种，蒙药1 3 4 2 种，傣药1 2 0 0 种，苗药1 0 0 0 种， 维药6 0 0 种，彝药及羌药各百余种。 天然药物自古以来就为人类健康服务，人类在与疾病作斗争的过程中，通过以身 试药，日积月累，对天然药物的应用积累了丰富的经验。在我国，天然药物( 中草药) 与中医一起构成了中华民族文化的瑰宝，也是全人类的宝贵遗产。天然药物之所以能防 病治病，其物质基础在于所含的有效成分。研究中草药的有效成分，目的在于研究有效 成分的化学结构、理化性质与生物活性之间的关系【3 】，逐步阐明其防病治病的原理寻找 新药物、新药源或开发利用对国民经济有价值的资源同时，对探索中草药加工工艺，改 进药物剂型，控制中药及其制剂的质量，提高临床疗效，都有重要的意义。然而一种天 然药物往往含有结构、性质不相同的多种成分。例如，中药麻黄中就含有左旋麻黄素 等多种生物碱类物质，以及挥发油、淀粉、叶绿素、纤维素、草酸钙等其它成分；中药 甘草中则含有甘草酸等多种皂甙以及黄酮类、淀粉、纤维素、草酸钙等成分。以上两例 中，左旋麻黄素具有平喘、解痉作用，甘草酸则具有消炎、抗过敏、治疗胃溃疡的作用， 迷迭香有效成分的提取与结构研究 它们分别被认为是麻黄与甘草中的代表性有效成分。现代科学给天然药物的开发利用带 来了巨大的变化。对于天然药物进行化学研究更为重要的意义是对于有效成分进行化学 结构的改造，从而改变药物的性质( 理化特性、生物利用度、治疗指数等) ，产生高效 低毒的新药。同时，对于某些资源有限的天然药物，结构简单的也可用全合成的方式 来生产，较为复杂的则能通过结构改造变成比较容易合成的衍生物。在现代药物研究中， 几乎每一次具有轰动效应的药物的出现都伴随着一种或一类新型天然药物的发现，倾注 着天然产物化学家的研究成果。另外，天然药物化学的研究为分子药理学的发展做出了 巨大的贡献，许多药理学的分子机制是对强活性天然药物作用机理的研究中建立的同 时，不少强活性天然药物作为分子药理学的生物探针被广泛应用。具有特征结构和生理 活性并可通过结构改造优化其生理活性的化合物常常作为先导化合物，从中筛选生理活 性强的、有典型结构的化合物做为模型，并依此模型通过结构改造合成出具有更好效果 的药物或农药，这是医药研究和农药开发的常规思路之一，并在商业上已取得很大的成 功。 1 1 2 天然药物发展的良好机遇 随着现代分析测试方法、药理学、分子生物学的发展，天然药物化学的研究方法 和条件日趋进步，使得天然药物的研究领域和深度得到了长足的发展1 4 j 。一方面天然药 物化学的研究手段日新月异，提取分离手段及中试放大设备得到改善，传统的提取分离 技术大多存在提取效率低、成本高、提取过程选择性差、分离纯化过程复杂和污染严 重等问题。而随着现代化工、机械制造技术等的进步，使得超临界萃取、树脂分离技术、 膜过滤、超滤、澄清剂、模拟流动床分离技术等提取分离技术日趋成熟，在天然药物标 准提取物，有效成分的工业化生产中得到了广泛的应用【5 j 。随着波谱技术的广泛应用， 天然药物化学的发展取得了显著的进步。另一方面，天然化合物结构鉴定技术得到飞速 发展。随着波谱手段的不断进步，未知化合物的结构测定工作越来越高效、准确，m 、 n m r 、x 射线单晶衍射等在设备、性能及测试技术方面均得到了显著的改善，结构测定 样品量已降低到几个毫克就可以完成测量工作。分子量1 0 0 0 以下的大多数天然化合物 可不经过任何化学降解，仅用常规n m r 技术就可以确定分子结构。尤其是随着高场磁 体和梯度场探头的广泛应用，多维n m r 脉冲技术的开发变得随心所欲，许多高分子化 合物，包括生物蛋白质的三维结构通过n m r 就可以测定其结构。 2 l 世纪人类社会进入老龄化社会，疾病谱发生了重要改变。慢性病，特别是神经、 内分泌系统疾病、心理障碍、心脑血管系统疾病、因衰老引起的功能低下性疾病的发病 比率相应增加。同时，医疗观念和医疗模式也发生了重要改变，由单纯的疾病治疗转变 为预防、保健、治疗、康复相结合的模式。强调对慢性病，特别是多脏器慢性病的治疗， 强调对亚健康状态的及时调整和恢复，强调对机体功能平衡状态的调节等；医药经费的 2 海南大学硕士学位论文 投入模式也随之发生重要改变。加上在慢性疾病、疑难病及一些西医、西药不能治疗或 疗效不理想的难治性疾病的治疗和保健方面，中医药拥有独到的理论体系和丰富的临床 实践，具有独特的优势。目前，德国、英国、澳大利亚等国家都己立法，直接或间接给 一予中药合法地位：美国f d a 出台了植物药品指南后使中药成为药品进入美国的 主流市场有了法律上的保障。这些都为天然药物的发展带来了良好的机遇 6 1 ，2 1 世纪将 是天然药物的时代。 在人类回归大自然的国际潮流中，世界各国均已意识到天然药物巨大的医疗价值和 市场潜力，对包括中药在内的天然药物日益重视。欧美国家近年对天然药产品的态度已 明显转变，国际天然药物市场正迅速扩大。统计数据表明全球约有8 0 的人以天然药物 作为基本医疗保健手段 7 1 ，国际植物药增长速度高于医药产品平均速度( 1 0 以上) ，西方 发达国家植物药市场的年增长率达到2 0 以上，大大超过了化学药品的增长速度。 目前，已发现人类患有3 万多种疾病，其中1 3 靠对症治疗，极少数能够治愈，大 多数尚缺少有效治疗药物。以往工业化国家多用合成药物，其副作用、抗药性及药源性 疾病多。随着科学的进步，人们自我保健意识增强，对天然药物的认识深化，回归自然 愿望日趋高涨，对天然药物需求增加，加之合成药开发周期长，投资大，企业难以承受。 目前，从天然药物中获取新药已经在全球范围内形成了有组织、有计划的创新行为，来 自天然药物活性成分的新药已经在临床上大范围使用，全球药品市场中天然来源的药物 制剂已经占临床药物的3 0 ，青蒿素、紫杉醇等已经成为临床不可或缺的一线药物。同 时，越来越多的研究工作更注重于天然产物的生物活性研究。因此，世界各国均着力于 天然药物的研究，掀起了开发的新热潮，促进了天然药物的迅速发展。 1 1 3 我国天然药物的发展现状 在世界四大传统医药体系( 中国、埃及、希腊、印度) 中，我国是中医药理论的发源 地，是理论最完善、医疗实践最丰富、疗效最确切的传统医药体系，也是世界植物药资 源的大国，天然植物药( 中草药) 种类最多，约占总数的8 7 。与中医理论一起构成了民 族文化的瑰宝。 但是，目前我国中药在国际天然药物市场中所占的份额只有3 5 ，而且基本上 都是中药材的贸易【8 j 。日本和韩国对汉方药的研究和开发都走在了我国的前头，欧美国 家更是凭借其强大经济实力、综合研发能力及其对知识产权保护的敏锐嗅觉，正在加紧 掠取我国传统中医药的宝贵资源。如：7 0 年代日本选择我国的古方2 1 0 个批准为医疗用 药，随后引起了日本“汉方制剂”工业的蓬勃发展，1 9 9 4 年产品国内销售额己达1 5 0 0 亿 日元，超过了我国中成药的年销售总额。面对严峻的挑战，唯一出路是尽快实现我国中 药的现代化与国际化。 我国药用植物及中药材种类繁多，新版中药大辞典将收载1 2 8 0 7 种中药材，其 3 迷迭香有效成分的提取与结构研究 中药用植物种1 11 4 6 种，动物1 5 8 1 种，矿物8 0 种。此外其他民族地区尚有藏药2 2 9 4 种，蒙药1 3 4 2 种，傣药1 2 0 0 种，苗药1 0 0 0 种，维药6 0 0 种，彝药及羌药各百余种。 目前人工种植的药材2 0 0 余种，6 0 0 余万亩，生产基地6 0 0 多个，对具有药用作用的野 生动物也进行了人工饲养。我国有几千年的中医药历史，有独一无二的中医药理论，已 有记载的中药古方6 万多个，这就为我国开发新的天然药物提供了雄厚的物质、理论及 技术基础。当今世界已进入信息社会新经济时代，我国己加入w t o ，必须参与经济全 球化竞争，国内医药界企业家应树立全球化观念，抓住机遇，推行现代化管理机制，加 大科技投资力度，充分挖掘和利用自然界结构多样性的化合物开发新的天然药物，促进 我国医药科技高速前进，开拓新的市场，推动我国天然药物的发展，迎接医药经济全球 化挑战。 1 2 迷迭香的性状及资源分布 迷迭香( r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl ) 别名艾菊，系唇形科迷迭香属植物。灌木1 9 】，高 达2 米，茎及老枝圆柱形，皮层暗灰色，不规则的纵裂，块状剥落，幼枝四菱形，密被 白色星状细绒毛。叶常常在枝上丛生，具极短的柄或无柄，叶骗线性，长1 2 5 厘米， 宽1 2 毫米，先端钝，基部渐狭，全缘，向背面卷曲，革质，上面稍具光泽，近无光， 下面密被白色的星状绒毛。花近无梗，对生，少数聚集在短枝的顶端组成总状花序；苞 片小，具柄。花萼卵状钟形，长约4 毫米，外面密被白色星状绒毛及腺体，内面无毛， 1 1 脉，二唇形，上唇近圆形，全缘或具有很短的3 齿，下唇2 齿，齿卵圆状三角形。花 冠蓝紫色，长不及1 厘米，外被疏短柔毛，内面无毛，冠筒稍外伸，冠檐二唇形，上唇 直伸，2 浅裂，裂片卵圆形，下唇宽大，3 裂，中裂片最大，内凹，下倾，边缘为齿状， 基部缢缩成柄，侧裂片长圆形。雄蕊2 枚发育，着生于花冠下唇的下方，花丝中部有2 向下的小齿，药室平行，近1 室能育。花柱细长，远超过雄蕊，先端不相等2 浅裂，裂 片钻形，后裂片短。花盘平顶，具相等的裂片。子房裂片与花盘裂片互生。 迷迭香属于唇形科迷迭香属植物，原产于地中海沿岸地区【l 引，广泛生长于西班牙、 法国、意大利、突尼斯、摩洛哥和土耳其等欧洲及其毗邻的北非诸国，历史相当悠久。 据不完全统计，法国有迷迭香4 0h m 2 ，意大利有迷迭香4 5l a m e ，北非摩洛哥的野生和人 工种植迷迭香面积超过1 00 0 0h r n z ，其中种植面积为20 0 0h m 2 ，每年生产2 0 吨迷迭香 精油，土耳其每年迷迭香干叶的产量也有4 5 0 吨。 我国在晋朝前就已引种【l ，近年来已在云南、福建、广西、贵州等地大面积栽培， 目前种植面积有：云南玉溪1 3 3 h m 2 ，福建长汀l o o h m z ，广西柳州1 3 3 h m 2 ，广西上林 1 3 3 h m 2 ，贵州独山1 1 3 h m 2 等【1 2 1 。中科院植物所、北京植物园于1 9 8 1 年底自国外首次引 进迷迭香，植物栽培试验取得成功，接着在烟台、连云港及杭州等地进行了小面积试种。 现在贵州独立山县已成为生产迷迭香的主要基地。迷迭香适合生长在温暖、相对干燥的 4 海南大学硕士学位论文 沙质土壤中i l ”，对5 以下的低温和3 0 以上的高温较敏感，生长速度较慢，它耐早 忌涝，喜欢温暖湿润的气候环境，适宜的生长温度是1 5 3 0 ，在5 下持续5d 会被冻死，大于3 5 则会休眠。它对土壤的要求不严，适应性广，但以疏松的沙壤土 为佳。迷迭香一般用扦插法繁殖，其成活率在9 0 以上，试验扦插6 0 0 株成活率为9 8 。迷迭香一次栽种多年采收我国南方四季均可收割，以4 8 月的产量最高1 1 4 1 。每 次采收鲜叶及嫩茎，收割的干枝率为4 1 4 5 ，每亩采收2 5 0 3 5 0k g 为宣。g r e a v e s 等提出根据迷迭香的产量、生长习性、抗病、酚型的抗氧化效能等基因差异，通过控制 遗传基因来培育迷迭香，为迷迭香产业化提供了优质高产的原料。 图i - 1 生长的迷迭香1 7 5 i f 培i - 1g r o w t ho f r o s e m a r y 图1 2 迷迭香干叶p 5 】 f i g1 - 2r o s e m a r yl e a v e s 迷迭香有效成分的提取与结构研究 1 3 迷迭香的应用 早在我国战国时期就有记载，其功效为：本草拾遗：“主恶气“ ；国药的药理 学；“芳香健胃，亢进消化机能；中国药植图鉴；“强壮、发汗、健胃、安神、 能治各种头痛，和硼砂混合制备浸剂，能防止早期秃头“ 。 迷迭香在欧洲的传统用途【l0 1 ，是作为日常厨房烹饪用香草佐料，使用非常广泛，被 用于许多食谱中。烹饪用迷迭香，可以使用迷迭香鲜叶或干叶，欧洲各国主要从西班牙、 以色列、哥伦比亚和塞浦路斯进口迷迭香鲜叶，干叶主要来自西班牙和北非地区。冷藏 保存的鲜叶贮存期较短，冷冻保存的鲜叶贮存期较长，干燥后的叶子可长期存放。 迷迭香在欧洲的另一项重要用途，是提取加工迷迭香精油，用作各种香精香料制品 的原料，一般通过水蒸气蒸馏法生产迷迭香精油，也有采用超临界c 0 2 萃取方法。迷 迭香精油的主要成分是各种单萜类化合物，包括：0 【蒎烯、莰烯、p 蒎烯、1 ，8 桉叶素、 樟脑、乙酸龙脑酯、龙脑和马鞭草烯酮等。西班牙和北非还曾利用迷迭香精油生产高含 量的天然樟脑。迷迭香在欧洲的近期用途，是由迷迭香叶子提取迷迭香抗氧化剂，主要 成分包括：鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等。迷迭香在欧洲还被作为园林花卉的观赏 植物，迷迭香植物有直立型和匍匐型等品种，花的颜色有白色、粉红色和蓝色，叶子常 绿，并散发特殊香气。 作为香辛料，迷迭香已经广泛地应用于食品工业。迷迭香鲜品及干品在国外主要用 作烹饪的佐料，精油用于日用化工及食品工业增香。迷迭香的水溶性及脂溶性的抗氧化 剂成分在食品工业主要用于：稳定油脂、抑制衰败及类胡萝卜色素褪色，防止经久煮或 粉碎的禽类和鱼类产生过熟味，同时还能改进低p h 值调味酱汁的风味。陈美云等l l 纠人 的研究显示，迷迭香抗氧化成分不仅活性高，不易挥发，具有良好的稳定性，而且还是 一种高效理想的天然抗氧化剂。例如，在密封条件下，将迷迭香抗氧化剂在2 0 4 加热 1 8 h ，或在2 6 0 下加热l h ，其活性都不受影响；在不同油脂中比b h a 抗氧化效果强1 6 倍；能长期耐受1 9 0 的高温油炸而具有抗氧化效果；对各种复杂的类脂物氧化有广 泛而很强的抑制效果。y c h em a n 等【l6 】人曾就迷迭香和鼠尾草降低油脂的过氧化值效 果进行了研究，发现两者均极大地降低了油脂深层油炸时氧化的程度。屠鹏飞等【l7 j 报道 了国外迷迭香抗氧化剂在食品工业中的广泛应用，如鱼类、油炸食品、腊肠、牛肉汉堡 包等。杨燕【1 8 】也介绍了迷迭香抗氧化剂在多种食品中的应用。曾伟等报道了迷迭香抗氧 化剂，在猪油和大豆油中，使用效果高于b h t 和v e ，以及在火鸡馅中显示出的抗氧化、 护色的明显效果。此外，迷迭香抗氧化剂在食用色素的颜色上，其抗氧化稳定作用亦十 分明显。 在医疗方面，传统中医药认为，迷迭香性温昧辛，具有芳香健胃，镇静安神等功效， 常用于治疗各种头痛，神经衰弱【1 9 1 等。1 9 8 3 年欧洲国家已用迷迭香提取物开发出治疗静 6 海南大学硕士学位论文 脉曲张、痔疮、湿疹、牛皮癣和皮肤感染等的药物。近年来，人们对迷迭香研究较多， 也较为深入。研究证明，迷迭香不仅能抗菌、抗炎、健胃、利胆、止痛、促进毛发、 平喘止咳，而且具有抗肿瘤、抗癌的作用。迷迭香提取物在医药方面正表现出了极大的 潜在应用前景。国内外许多研究实验表明，迷迭香提取物具有一定的抗炎、抗溃疡、抗 癌和抗艾滋病的作用，可望成为新药源。饶光宇等观察到迷迭香的双萜酚对小鼠肝损伤 有着良好的保护作用，并且毒性很小，很可能成为保肝降酶新药。屠鹏飞等【l 。7 】在文章中 叙述了国外迷迭香酸在抑制血栓和免疫调节的作用。目前，在药物应用上，德国 n a t t e r r n a l m 公司已将迷迭香酸作为解热、镇痛、抗炎药在市场销售。曹树稳等【2 0 】人对迷 迭香提取物的抗乳腺癌活性进行了研究，发现迷迭香主要抗氧化组份对乳腺癌细胞增殖 呈现较强的抑制活性，其中鼠尾草酚的抑制活性具有良好的选择性，是一个极有希望的 乳腺癌增殖抑制剂。 此外，迷迭香精油还具有杀菌、杀虫、消炎等功效，现广泛用于香水、浴液、 化妆品、洗发水、空气清新剂、驱蚁剂等日用化工品。日本用迷迭香提取物开发出抗自 由基的专利化妆品和防治真菌的洗发水【2 1 1 ，西班牙已用迷迭香水提物开发出具有防止脱 发、秃头、头皮屑及刺激头发生长、增长头发韧性作用的专利洗发水。 1 4 迷迭香的研究现状 欧洲各国特别是英国、法国、德国、西班牙、意大利和瑞士，在迷迭香的科研、标 准、种植、加工、利用和贸易方面都有涉足【l 们。目前欧洲很多国家都在大面积种植迷迭 香，其应用价值越来越受到人们的关注，有很多专门的研究所和公司对迷迭香、迷迭香 提取物及其它天然抗氧化剂进行研究。欧洲迷迭香研究范围包括选种、杂草控制、栽培、 分析、提取及单体化合物等内容。提取方法上，英国对多种迷迭香抗氧化剂提取方法， 主要采用超临界萃取和超声强化提取等技术；德国迷迭香加工主要采用溶剂提取和水液 提取法，也具备超临界c 0 2 提取的能力；西班牙从事迷迭香精油和提取物生产采用乙醇 水提取、迷迭香的超临界c 0 2 提取和过热水提取等。 1 4 1 迷迭香的提取方法 近年文献主要研究含量较高并具有重要用途的成分：迷迭香精油和抗氧化剂化合物 如：迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸等。国内外学者主要 用水蒸气蒸馏法提取迷迭香挥发油制备精油，也有用到超临界流体萃取( s c f e ) 法来提取 挥发油的，提取挥发油后的原料可继续用来提取脂溶性抗氧剂成分。 从迷迭香叶子提取抗氧化剂时，一般用得比较多的是用溶剂萃取法。萃取法即两相 溶剂提取，是利用混合物中各组分在两种互不相容的溶剂中分配系数不同而达到分离目 7 迷迭香有效成分的提取与结构研究 的的方法。萃取法是天然有机化合物分离中常用到的分离方法【2 2 j 。对于已知的化合物的 结构，可以直接根据相似相溶的原理和有关萃取剂选择规律，从而选择一种合适的萃取 剂把目的化合物萃取出来。当对某种天然产物进行系统分离时，一般先用不同极性的有 机溶剂萃取，把提取物分成不同极性范围的部分，以便于下一步的分离。溶剂萃取一般 先经过预处理，如发酵水解处理，使细胞壁破碎，从而能最大量地释放出活性产物，提 高多酚的提取率，此外还需除去精油，然后用萃取的方法提取抗氧化剂。董文宾 2 3 1 、杨 海麟【2 4 】等对迷迭香的溶剂提取方法进行了研究。有机溶剂提取法，对抗氧化剂的活性部 分缺乏有效的选择性，提取效率低，同时会有少量溶剂残留在抗氧化剂中，而食品工业 对溶剂的残留有一定的限制，此法还存在着挥发性化合物可能损失的缺点。 针对溶剂萃取法缺点很多研究者考虑使用超临界流体萃取( s c f e ) 法。它是利用液 态c 0 2 作为萃取溶剂，c 0 2 具有好的溶解性能、低的化学反应性，低毒、不燃、价格 低廉、能稳定地循环使用，在提取物中不会留下不希望的残留物等许多优点。此法能使 抗氧化剂中的精油和溶剂残留得以控制，能避免对产品活性和颜色方面造成的负面影 响。s c f e 法提取时，需要寻求和选取适宜的提取条件，工作量较大，为此，研究者们 展开了大量的基础研究工作。例如，i b a n e z 等【2 5 利用胶束电动色谱法( m e k c ) ，快速地 获得提取物分离的条件，实现对s c f e 的调节，以得到高质量的提取物。超临界法提取 能够使氧化剂和精油中的溶剂残留得以控制，但也存在一些弊端，在探索和选择适宜的 条件时，工作量较大，且超临界萃取仪器精密度高，价格昂贵。 过热水萃取法，b a s i l e 等【2 6 】用过热水对迷迭香进行提取实验。有机物在过热水中的 溶解远大于室温时的水。用大于1 0 0 的水进行提取，通过实验，认为过热水能从迷迭 香中快速提取含氧化合物，提取得率高于水蒸气蒸馏法。此工艺虽需大量水，但不要求 水气化，热量大部分能够循环，能耗的成本很有竞争力。它与c 0 2 的s c f e 法相比，对 植物原料而言，s c f e 法为有效地实现超临界萃取，c 0 2 对原料之比需采用高的质量比： 植物原料还需要干燥，不仅增加成本，而且存有挥发性芳香化合物损失的可能性。但是 过热法萃取所能提取到的成分比较有限。 迷迭香提取方法的研究虽多，前述几种方法均为实验室的基础实验方法，生产工艺 很少有报道，一般以专利形式报道居多。n g u y e n 等【27 j 的专利，用s c f e 法提取迷迭香 抗氧化剂，设备包括一个提取器和两个分离器。由于它的提取效率和提取速率，随着 c 0 2 的压力增高而增大，因此，在压力低于3 5m p a 时，操作是不经济的，而应在5 0 - - 1 0 0m p a 下提取为佳。提取温度高于1 1 0 时，由于对提取成分的热影响，会降低抗氧 化剂的活性，一般在9 0 “ - - - 1 1 0 可得到最好的提取产率和速率。在第一个分离器收集得 到浅绿褐色固体或半固体的抗氧化剂提取物，在第二个分离器收集到绿褐色的芳香精油 和水。金坚敏的专利，用丙酮等有机溶剂与迷迭香混合，回流提取，浓缩至浸膏，水蒸 气蒸馏浸膏得到迷迭香精油和残留物，用乙醇溶解此残留物，经冷冻分离、过滤，得上 层清液和沉淀物，并分别用活性炭进行脱色处理。该法将有效成分进行了分组，分别得 8 海南大学硕士学位论文 到两种抗氧化剂，得率约为lo 。迷迭香抗氧化剂的生产工艺虽然各有不同，但都存在 相似之处，都是源自传统提取方法。 1 4 2 迷迭香的化学成分【2 8 】 迷迭香精油化学成分可分为5 类【1 0 1 ，分别为：樟脑蒎烯、乙酸龙脑酯、1 ，8 桉叶 素、马鞭草烯醇和月桂烯。一般认为，迷迭香精油成分和含量与迷迭香种源、产地、采 收期及精油加工方法等都有一定关系。迷迭香植物根据精油组成的不同，可以分为两大 主要化学类型，分别为：( 1 ) “低1 ，8 桉叶素蒎烯与高樟脑”型( 亦称突尼斯摩洛哥型) ， 此类型迷迭香主要产自法国、希腊、突尼斯和摩洛哥等国，精油组成大致为：a 蒎烯9 1 4 、1 ，8 桉叶素1 7 2 5 、莰烯8 1 3 、樟脑1 2 5 2 2 、b 蒎烯2 5 、 龙脑2 4 5 、乙酸龙脑酯0 4 2 5 ；( 2 ) “高1 ，8 一桉叶素蒎烯与低樟脑”型( 亦 称西班牙型) ，此类型迷迭香主要产自西班牙、葡萄牙、前南斯拉夫和意大利等国，精 油组成大致为：a 蒎烯1 8 - - - ，2 6 、1 , 8 桉叶素3 8 - - 一5 5 、莰烯2 5 6 、樟脑5 1 5 、b 蒎烯4 9 、龙脑1 5 、乙酸龙脑酯0 1 1 6 。 迷迭香中含的化学成分比较多，目前醇提物中分离出来鉴定的成分可以分为几大 类【2 9 】，主要有黄酮类、萜类、有机酸。 黄酮类：从迷迭香中提取的到黄酮研究较早，至今已从其茎、叶中分离、鉴定了 3 3 个黄酮类化合物：6 甲氧基木樨草素、5 羟基7 , 4 - 二甲氧基黄酮、5 ，4 二羟基7 甲氧基黄酮、橙皮甙、异橙皮甙、香叶木甙、高车前甙、械叶泽兰素一3 o 葡萄糖甙、 械叶泽兰素4o 葡萄糖甙、木樨草素3 o 葡萄糖醛酸甙、木樨草素、香叶木素、芫花 素、6 甲氧基3 ，4 二轻基黄酮7 o 葡萄糖甙、芫花索4 甲醚、粗毛豚草素、木樨草素 7 葡萄糖甙、3 ，5 ，7 ，三羟基黄酮、8 甲氧基山奈酚、棚皮素、山奈酚、芹菜素、白杨素、 高粱姜素、藤黄菌素3 - o 。p d 葡萄糖醛酸甙、藤黄菌素3 - o ( 4 o 乙酰基) b d 葡萄糖 醛酸甙、藤黄菌素3 - 0 ( 3 o 乙酰基) b d 葡萄糖醛酸甙、c i r s i m a r i t i n 、p h e g o p o l i n 、 n e p i t r i n 、a p i g e t r i n 、s a l v s 等黄酮。 迄今为止从迷迭香中分离鉴定数量最多的是萜类成分，包括单萜、倍半萜、二萜及 三萜类化合物，其中以二萜类化合物最具开发和研究价值。单萜及倍半萜类，此类化合 物比较复杂。提取方法除水蒸气蒸馏外，应用较多的还有超临界萃取，采用的分析方法 主要g c m s ，其精油成分和相对含量随产地不同而异。二萜类的成分主要为二萜酚和 二萜醌类化合物。前者为抗氧化的主要活性成分。目前己从其茎、叶中分离鉴定了迷迭 香酚、表迷迭香酚、异迷迭香酚、鼠尾草酚、铁锈酚、7 甲氧基迷迭香酚、7 乙氧基迷 迭香酚、迷迭香二醛、鼠尾草酸、迷迭香二酚、迷迭香宁、异迷迭香宁；二萜醌类有迷 迭香醌、r o y l e a n o n e 和表丹参酮。从根中分得7 - a h y d r o x y r o y l e a n o n e 、 6 ，7 d e h y d r o r o y l e n o n e 、h o r m i n o n e 和落羽松二醌。 9 迷迭香有效成分的提取与结构研究 从该植物中分得的三萜多为三萜酸类，母核类型为乌索烷型、齐墩果烷型和羽扇 豆烷型。主要有：桦木醇、桦木酸、1 9 a 羟基熊果酸、2 - 1 3 羟基齐墩果酸、3 - 1 3 羟基乌 索烷1 2 ，2 0 ( 3 0 ) 二烯1 7 酸、齐墩果酸、熊果酸、表g t 香树脂醇、i ，蒲公英赛醇、仅、 p 香树脂素、羽扇豆醇、蒲公英赛醇、蒲公英甾醇、日耳曼醇、胆甾醇、菜油甾醇、谷 甾醇、r o f f i c e r o n e 、a 白檀酮、p 白檀酮、3 o 乙酰基齐墩果酸、3 o 乙酞基熊果酸、表 0 【香树脂醇等。 有机酸主要为迷迭香酸、咖啡酸、绿原酸、r o s m i ea e i d 、阿魏酸、l 抗坏血酸等。 另外，迷迭香叶中换含有多种脂肪酸、直链或支链烷烃和多种氨基酸。 1 5 本研究的目的和意义 从研究报道中可以看出，迷迭香的提取成份既具有抗氧化作用，又具有抗微生物作 用，且对人体无害，已成为当代公认的第三代食品抗氧化剂。随着人民生活水平的不断 提高，多领域对于天然抗氧化剂的需求将会迅速增长。迷迭香提取物除在食品中广为应 用外，在日化、医药等其它方面潜在的市场将不断扩大。目前，我国迷迭香抗氧化剂的 产量很少，技术落后。为了进一步开拓迷迭香产品的市场，有必要抓紧组织力量，进行 这方面的研发工作。 本研究拟对迷迭香的有效成分进行全面深入的研究，利用传统的分离提取技术和现 代先进的分析测试技术相结合，对迷迭香的有效成分进行提取分离分析。首先利用传统 的水蒸气蒸馏法提取迷迭香中的挥发性精油，采用g c m s 对迷迭香精油进行分析，得 出精油的主要成分，进一步研究其抗氧化性；再利用传统的溶剂提取法提取分离迷迭香 中的单体，期望能分离出更多更新的单体化合物，并对分离产物进行结构分析研究，确 定各产物的结构，为下一步进行相关药理活性研究提供依据，使迷迭香具有更广阔的开 发利用前景。 本研究采用传统分离提取技术并结合现代分析测试技术，课题期望站在前人研究的 基础上分离出更多新的化合物，为迷迭香在药用领域的开发应用提供依据。 1 0 海南大学硕士学位论文 第二章迷迭香精油的提取及其抗氧化性的研究 2 1 迷迭香精油的提取 2 1 1 实验原料、仪器 迷迭香 水蒸气蒸馏装置 气质联用仪