生、制首乌醇提物对小鼠肝脏的影响

【摘要】 目的：观察炮制对何首乌醇提物不同剂量长期给药对小鼠肝脏的影响。方法： 生首乌醇提物、制首乌醇提物按大、中、小剂量灌胃，连续 60 d，对受试动物进行血液生 化指标及病理组织学的检测。结果：生首乌醇提物小剂量肝指数、病理学积分与空白组比 较差异有统计学意义(P0.05)。结论：生首乌醇提物临床等效量连续给药 60d，对小鼠肝脏存在损伤。 【关键词】 生首乌;制首乌;醇提物;肝脏损伤 ABSTRACT Objective： To observe influence of ethanol extract of Polygonum multiflorum on mice liver before and after processing. Methods： Ethanol extracts of raw and processed Polygonum multiflorum at large， medium and small dosages were repeat administered to mice for a consecutive 60 days， then blood and tissues of the sacrificed animals were detected and compared. Results： Compared with the control group， the liver index and pathology of small dosage group were significantly different from that of the negative control group， while other groups only showed similar tendency. No significant difference was observed between the negative control group and other groups regarding to the biochemical indicators. Conclusions： Consecutive administration of ethanol extract of raw Polygonum multiflorum for 60 days can induce liver damages in health mouse. KEY WORDS Raw Polygonum multiflorum; Processed Polygonum multiflorum; Hepatic damage 何首乌为蓼科植物何首乌 Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。生首乌具有解毒、 截疟，润肠之功效，制首乌具有补益精血，固肾乌须发之功效。临床多以制首乌入药，治 疗肝肾不足，精血亏虚、须发早白等诸症，现代还用于治疗动脉硬化症、高脂血症等。随 着临床应用的增加，何首乌不良反应的临床报道逐年增多，尤其是导致的肝脏损伤问题， 引起人们的关注1。已有研究认为何首乌的毒性成分可能为蒽醌类，主要存在于醇提物中， 为进一步验证其毒性成分，本实验室选取生、制首乌醇提物进行长期给药。本实验前期测 得制首乌醇提物 LD50 为 606 g/kg，生首乌醇提物 LD50 为 288 g/kg，本实验根据其临床用 量，结合 LD50，设定大、中、小剂量组，大剂量接近各自 LD50 的 1/2，中剂量为 1/4，小 剂量为临床等效量，给小鼠连续灌服 60 d，以观察生首乌醇提物、制首乌醇提物不同剂量 对小鼠肝脏的影响。 1 实验材料 1.1 实验动物 KM 小鼠，雌雄各半，体重 1822 g。购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格 证：SCXK(沪)2007-0005。 1.1.2 实验药品 生、制首乌均购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，为药典收录品种蓼科植物何首乌 Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥块根。生首乌批号：100116。制首乌批号：091113。 生首乌醇提物制备：取生首乌药材加 8 倍量的 90%乙醇回流提取 2 次，1 h/次，合并滤液， 回收乙醇后，浓缩至含生药量为 20 g/mL(批号：20100210)。制首乌醇提物制备：同生首乌 醇提物制备工艺，含生药量 28.7 g/mL(批号：20100209)。临用前配成所需浓度。 1.1.3 实验试剂 天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒：日本世诺临床诊断制品株式会社 批号： F025、F020;丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒：日本世诺临床诊断制品株式会社 批号： L922、F020;总胆红素试剂盒：北京利德曼生化股份有限公司，批号：00911LY;生理盐水： 山东华鲁制药有限公司，批号：B08110807。 1.1.4 仪器 日立 7020 全自动生化仪：日本日立公司;JA5003 电子天平：上海精密仪器有限责任公 司。 1.2 实验方法 1.2.1 毒性实验 实验动物按体重随机分为空白组;生首乌醇提物大、中、小剂量组分别为 150 g/kg、75 g/kg、2.4 g/kg;制首乌醇提物大、中、小剂量组分别为 300 g/kg、150 g/kg、2.4 g/kg，每组 8 只。每日称重、灌胃给药，给药体积为 0.25 mL/10 g，连续 60 d。于第 60 天各组小鼠眼 眶静脉丛取血，检测 ALT、AST 以及 TBIL，称量肝脏重量，计算脏器指数。脏器指数计 算公式：脏器指数(MG/10G)=脏器重量/体重100。 1.2.2 病理组织学检查 取部分肝脏固定于 10%福尔马林溶液内，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片，HE 染 色，由病理专业人员在光学显微镜下阅片，检查肝细胞有无变性(水肿、脂变)、嗜酸性变、 坏死;有无肝窦扩张、淤血，枯否氏细胞有无增生;门管区有无纤维组织增生及炎细胞浸润。 根据病变轻重程度，依次半定量为轻微()0.5 分，轻度(1+)1 分，中度(2+)2 分，重度(3+)3 分，无病变组织为阴性 0 分。 1.3 统计学处理 计量资料以(x-s)表示，用单因素方差分析进行组间比较，病理组织学检查评分采用 秩和检验，检验水准 =0.05。 2 结果 2.1 对血液生化指标的影响 给药 60 d 后，各给药组与空白组 ALT、AST、TBIL 差异均无统计学意义(P 均0.05)。 见表 1。表 1 生、制首乌醇提物对小鼠血液生化的影响 2.2 对脏器系数的影响 给药 60 d 后，与空白组相比，生首乌醇提物小剂量肝指数明显减小，差异有统计学意 义(P0.01)。见表 2。 2.3 病理组织学检查 各给药组病变主要表现为肝细胞变性，变性的类型以肝细胞水肿为主，其次为脂变、 嗜酸性变。水肿或脂变的肝细胞主要围绕在中央静脉周围，少数小鼠出现点状或小灶状坏 死。生首乌醇提物小剂量组与空白组相比，差异有统计学意义(P0.01)，见表 3、图 1AG。 表 2 生、制首乌醇提物对肝指数的影响表 3 生、制首乌醇提物对肝脏形态学 的影响 图 1 生、制首乌醇提物对小鼠肝毒性 HE 染色病理组织学检查的影响 3 讨论 近 10 年，何首乌及其制剂造成肝脏损伤的报道日趋增多，英国 MHRA 警告何首乌存 在肝损害，澳大利亚、意大利、荷兰、韩国等国也相继有关于何首乌引起肝脏损伤的临床 报道，其安全性问题引起了人们的重视2,3。国内鄢良春等1总结了近 20 年何首乌引起 肝脏损伤的临床特点，主要包括黄疸、尿色变深、恶心、呕吐、乏力、虚弱、腹痛、食欲 减退等，出现上述症状的时间是 2 周到 3 个月不等。多数患者服用的何首乌剂量较高，但 一些患者在正常剂量范围(612 g)内服用何首乌相关药物也会引发肝脏损伤4。国内所报 道的肝损伤均较轻，经对症治疗后多可恢复，或停药后即可自行恢复，偶有少数重症病例 5。有关实验室研究方面，张瑞晨等6利用生、制首乌不同提取物对人正常肝细胞进行实 验，发现脂溶性成分可使细胞阻滞于 S 期，并诱导细胞凋亡。胡锡琴等7应用制首乌水煎 液长期给大鼠灌胃，大鼠在血液生化指标未见异常的情况下，肝脏出现脂肪变性，偶见肝 细胞轻度萎缩或有炎细胞浸润。 本实验结果发现小鼠口服生、制首乌醇提物不同剂量 60 d 后，生首乌醇提物小剂量组 肝指数明显下降，病理学积分与空白组有统计学差异，其他组仅见趋势，各给药组的生化 指标与空白组比较均未见统计学差异。通常胞内酶 ALT、AST 在急性肝损伤、重度损伤时 从肝细胞内释放入血，血清中 ALT、AST 能明显升高，而在慢性轻度损伤时，血清中酶升 高不明显，提示何首乌产生肝脏损伤可能是非急性肝损伤，生化指标表现不显著。 在相同给药剂量下，生首乌醇提物组、制何首乌醇提物组引起的肝脏损伤无差异，可 能传统的炮制对于何首乌致肝毒性的成分未起到减毒的作用，其炮制对化学成分的改变有 待进一步深入研究。生首乌醇提物小剂量对肝脏的损伤最为严重，其毒性未呈现剂量依赖 关系。传统中药化学成分和药理活性通常十分复杂，可能在不同的剂量、患者体质等因素 作用下，会对机体产生不同的作用。临床用量下，何首乌的化学成分可能诱导肝药酶产生 更多的活性代谢物质，这些代谢中间产物可能是毒性成分，随着剂量的增大，药物可能抑 制肝药酶，产生活性代谢物质减少，毒性相应减少8。何首乌引起肝毒性还可能与机体自 身状态有关，随着患者机体状态不同可能会产生不同程度的损伤，个体差异较大，何首乌 具有免疫调节作用9，具备导致药物特异质反应或免疫介导肝损伤的条件。 本实验结果提示我们，在临床使用何首乌时应监测其产生肝损害的不良反应，积极探 讨其毒性机制，为何首乌安全用药提供一定的参考。 参考文献： 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007 年 03 期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效J;新中医;/book/main/index.php.1992 年 09 期 10 李东华;异维生素 A 酸治疗痤疮J;新医学 /;1993 年 10 期 11 黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察D;南方医科大学;2011 年 12 陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究D;广州中医药大学;2011 年 13 陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究D;广州中医药大学;2010 年 14 Hamid Abdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白 27、60、65、70 的影响D;北京 中医药大学;/book/main/index.php.2010 年 15 陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究D;广州中医药大学;2009 年 16 张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究D;复旦大学;2005 年 17 庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究D;中国医科大学;2008 年 18 申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁