生物制品中dna残留检测

系列资料：生物制剂中宿主残余系列资料：生物制剂中宿主残余 DNA 检测技术与标准的发展趋势检测技术与标准的发展趋势 系列系列 1. 生物制品中残留生物制品中残留 DNA 检测标准的变化检测标准的变化 2015 年 3 月底，中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中 新增加了一个编号为 410001 的产品：CHO 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 。这个由中检院与中科院联合研发，由生物制药企业参与标 定的试剂盒与现行美国药典（USP）建议的检测方法同步，但与 2010 版药典附 录中外源性 DNA 残留量测定法有所不同，可能会对国内生物制品的研发和生产 的上下游企业产生影响。 生物制品中宿主细胞残留 DNA 具有潜在致瘤和传染风险，所以各国药品监 管部门对 DNA 杂质的限量要求非常严格。美国药典在 General Chapter 介绍了三种常用技术，但将在 2015 年颁布的新版（USP38NF33）中增加全新 章节（General Chapter ）来进一步规范残留 DNA 检测的方法和标准物质。 与 1000 号以上的章节不同的是，USP 编号 1000 以内的章节详细规定了检测技 术、系统适应性标准和标准物质。新版 USP 中将唯一推荐 qPCR 法作为生物制 品中宿主残留 DNA 的标准方法。qPCR 法的技术优势在于序列特异性高、灵敏 度高、重现性好，可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可 靠的检测手段。 我国参照 WHO、FDA 和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余 DNA 含量进行限制。从卫生部颁布的人用重组 DNA 制品质量控制要点到近 年的中国生物制品规程都对 DNA 含量做了严格要求，部分标准高于国际标 准。2010 年版中国药典附录收录了 DAN 探针杂交法和荧光染料法，这两种方法 都存在技术缺陷，很难达到杂质限量检测的灵敏度，已经被欧美药典摒弃。目 前，仍有很多国内企业沿用这两种方法检测残留 DNA，致使生产工艺和产品质 量很难达到国际一流水平。根据残余 DNA 检测技术的发展趋势，小编预计我国 2015 版药典或增补版本中将出现 qPCR 方法。企业在生产与研发中采用中检院 标准物质目录中提供的成套试剂盒，可以大幅度减少费时、耗力、成本高昂的 方法学考察，只需开展少量方法适应性实验，就可以在生产工艺和质控体系的 优化方面发挥实际作用，同时满足美国 FDA 相关标准的要求。同时，联合研发 单位中科院湖州营养中心提供免费技术咨询和培训，帮助企业解决试剂盒应用 中的各种技术问题。 生物制品可用于治疗和预防疾病，关系到患者和健康人的用药安全，产品 质量必须得到保障。我国药品监管部门对生物制品中残留 DNA 的限量标准制订 的非常严格，但药典修订存在一定滞后性，附录中的检测技术与先进国家尚存 在差距，企业在研发和生产中应具有一定前瞻性，否则会使改进工艺、提高质 量、保障安全的努力大打折扣。 系列系列 2. 为什么要检测残余为什么要检测残余 DNA？ 生物制剂是制药行业中发展最快的领域，2014 年全球十大畅销药中 7 个是 生物制剂。这些销售上的重磅炸弹在临床上疗效确切，但研发成本高，生产和 质量控制要求非常严格。绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所 以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主 细胞残留 DNA 因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注 的重点。美国药典会从 2011 年开始就组织专门小组讨论修订生物制品中残留 DNA 检测方法，并在 2014 年 Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5 上宣布将在 2015 年药典修订版中增加新的章节（General Chapter ）来规范检测方法和标准物质。为什么美国药典会的专家组花几年时间讨 论一个微量成分（的 内容分别介绍一下这三种方法。 杂交法（杂交法（Hybridization-based）：在这种方法中，根据宿主 DNA 序列设计 DNA 探针用于测定产品中配对 DNA 的数量。双链 DNA 被变性成单链后固定在 尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA 探针被放射或荧光随机掺入标记以后，与膜上固 定的样品宿主 DNA 杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于荧 光标记的探针，斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析。斑点光密度对应结 合在目标 DNA 上的探针数，进而推测出残留 DNA 的数量。通过目测方法可以半 定量地检测样品中残留 DNA，仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线，对 应检测结果更加准确。 DNA 结合蛋白免疫阈值法（结合蛋白免疫阈值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：这种方法使用 DNA 结合蛋白和 DNA 抗体，分四步检测。第一步，通过加热把 DNA 变性成单 链 DNA，变性后 DNA 与偶联了亲和素的 DNA 结合蛋白以及偶联了尿素酶的 DNA 单克隆抗体混合反应，液相中的单链 DNA、DNA 结合蛋白、DNA 抗体共同 形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲和素- 生物素结合把 DNA 复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入检测 仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液 pH 值并被仪器记录变化。这种 pH 值的变化直接与样品中的 DNA 数目相关。第四步，仪器软件自动分析原始数 据确定样品中残留 DNA 数量。 定量定量 PCR 法（法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR 方法以其快速、高通量的 特点已经被应用于生物制药的一些领域（拷贝数检测与病毒检测） 。这项技术能 够确定各种样品中目标 DNA 序列的准确数量。DNA 探针的设计非常关键，这种 DNA 探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的 DNA 引物引导 DNA 聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA 聚合酶切断结合在 目标 DNA 上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。经过数十 个循环的 DNA 扩增，荧光信号与起始 DNA 模板成对应关系，对应标准曲线可以 准确计算出样品中残留 DNA 的数量。 美国药典附录进一步对三种方法进行了应用评价。杂交法可以序列特异性地 检测目标 DNA，但 32P 标记的探针因为存在半衰期短、放射等问题，实际应用 并不广泛。荧光标记的探针如果采用仪器读取信号，杂交法理论上可以达到定 量检测要求的灵敏度，但是检测时间需要 48 小时。阈值法因为是采用 DNA 抗 体的非特异序列免疫检测技术，不能特异性识别宿主残留 DNA 序列，且容易受 到环境和操作人员的 DNA 污染，导致读值偏高。qPCR 法具有序列特异性，灵 敏度、准确度、精密度都好，还可以高通量筛选，但开发一个合格的 q-PCR 试 剂检测宿主残留 DNA 并不是件容易的事情。有人会提出疑问，终产品中应该限 定任何物种的 DNA 残余以确保安全性，所以阈值法是不是最合理的分析方法？ 这里还需要强调一下宿主残余 DNA 检测的目的：1.确认纯化工艺合理，能有效 去除宿主 DNA 残余；2.确认产品中杂质含量符合标准要求。非特异性的 DNA 检 测结果不能区分究竟是生产中污染、检测污染、或是工艺缺陷引起的 DNA 残余， 就无法为解决方案提供有效信息。在严格的生产体系中，残留 DNA 检测是解决 工艺合理性问题，任何外源污染问题都归 SOP 或 GMP 管理体系解决。最后，经 典的残留 DNA 检测方法灵敏度不同，qPCR 法、DNA 结合法、杂交法的检测限 分别达到300pg）等原因，早已被欧 美药典摒弃。 我国 2010 版药典及 2015 版药典（附录 IX B 外源性 DNA 残留量测定法） 的征求意见稿中收载了的 DNA 探针杂交法和荧光染料法，而 2009 年美国 USP 就收录了杂交法、阈值法和 qPCR 法，到 2015 年底 USP 将只收录高灵敏度、高 特异性的 qPCR 法作为残留 DNA 检测的推荐方法。由此可见 qPCR 法将成为国 际公认的残留 DNA 检测方法，也可能会是我国下一版药典的主要修订内容。国 内生物制品研发与生产企业，以及生产纯化填料的上下游企业，尽早建立以 qPCR 方法为基础的宿主残余 DNA 检测体系，将有利于改进工艺、提高产品质 量，实现与欧美发达国家生物药品标准的接轨。 系列系列 5.5. 国家标准物质库中的试剂盒技术性能国家标准物质库中的试剂盒技术性能 为了提升国内企业和监管部门对生物制品中宿主残余 DNA 的检测技术水平， 实现与国际标准的接轨，中检院联合中科院、生产与研发企业开发了首个基于 qPCR 技术，具有自主知识产权的国产 CHO 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒。研 发中除了常规方法学研究和稳定性考察，还开展了 DNA 碎片化、种属特异性、 不同的仪器通用性、抗蛋白干扰、国外同类产品性能对比等研究，并在验证试 验中考察了对国内多家生产企业和研发企业不同样本基质的适用性。由中检院 采用国家标准物质 CHO 细胞 DNA 标定并验证的试剂盒提供了从样品提取、纯化 到 PCR 检测的整套试剂，定量灵敏度达到 10fg/rxn，DNA 片段大于 120bp，内 标加样回收率在 70130%（新版美国 USP 的标准将调整为 50