生物质谱工作原理及其应用

论文题目：生物质谱工作原理及其应用 论文要求： 生物质谱技术拥有广泛的应用及广阔的前景。简要概述生物质谱 的工作原理及其应用，要求内容充实，论述详细透彻，不少于 1000 字。 教师评语： 教师签字： 年 月 日 论文题目：生物质谱工作原理及其应用 一、质谱技术 质谱（ Mass SPectrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量） 的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电 场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检 测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组 成。 1.质谱分析的基本原理 用于分析的样品分子（或原子）在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子 离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子， 进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大， 速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依 然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相 交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比 而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦 面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱。 通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和 分子结构等多方面的信息。 2.质谱技术的发展 质谱的开发历史要追溯到 20 世纪初 J.J.Thomson 创制的抛物线质谱装置，1919 年 Aston 制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。 最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展， 质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到 20 世纪 50 年代后期已广泛地应 用于无机化合物和有机化合物的测定。 现今，质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金、电子、 航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。 质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特 的生物质谱技术。 二、 生物质谱技术 电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于 80 年代末期的两项轨 电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生 了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在 pmol（10-12 甚 至 fmol（10-15 的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为 可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。以 下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。 1.电喷雾质谱技术 电喷雾质谱技术（Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS）是 在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成 细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解 为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入 气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比 （m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分 析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。 电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用 （LCMS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。 2.基质辅助激光解吸附质谱技术 基质辅助激光解吸附质谱技术（MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用 激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热， 从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI 所产生的质谱 图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一对应关系。 MALDI 产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，理论上 讲，只要飞行管的长度足够，TOF 检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此 MALDI-TOF 质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。 3.快原子轰击质谱技术 快原子轰击质谱技术是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中 的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的 化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。 只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而 FABMSMS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生 物医学分析中迅速发展起来。 同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它 在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力， 该化合物又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中 同位素的含量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱在医学领域的应 用开辟了一条思路。 三、生物质谱技术的应用 随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许 多领域，特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用， 不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。 1.质谱与蛋白质分析 蛋白质分子量的测定 蛋白质类生物大分子分子量的测定有着十分重要的意义， 如对均一蛋白质一级结构的测定，既要测定蛋白质的分子量，又要测定亚基和寡 聚体的分子量及水解、酶解碎片的分子量。常规的分子量测定主要有渗透压法、 光散射法、超速高心法、凝胶层析及聚丙烯酸胺凝胶电泳等。这些方法存在样品 消耗量大，精确度低易受蛋白质的形状影响等缺点。 MALIMS 技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应 用，特别是在蛋白质分析中的应用，至今已被分析的蛋白质已有数百种之多，不 仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，还可直接用来测定蛋白质混 合物的分子量，也能被用来测定经酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序 列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。 蛋白质组研究 蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质 成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活 动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、 蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究 的三大支撑技术之一，除了用于多肽、蛋白质的质量测定外，还广泛地应用于肽 指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。 肽指纹图谱（ PePtide Mass Fingerprinting,PMF）测定是对蛋白酶解或降解 后所得多肽混合物进行质谱分析的方法，对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库 中蛋白质的理论肽片进行比较，从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的 蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。 采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。 对大肠杆菌经 PVDF 膜转印的蛋白质的研究表明，三个肽片即可达到对蛋白质的正 确识别。而采用原位酶解的方法对酵母蛋白质组研究的结果显示，约 90的蛋白 质被识别，其中三十多种新蛋白质被发现，而这些蛋白质是酵母基因组研究中未 能识别的开放阅读框架。研究显示，肽指纹谱的方法比氨基酸组成分析更为可靠， 这是因为 MALDI 测定肽质量的准确度为 999，而氨基酸组成分析的准确度仅为 90。另外 MALDI 可以耐受少量杂质的存在，对于纯度不是很高的样品也能得到 理想的结果。 对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的，它采用不同的质 谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解高，通过推断肽片的 断裂，即可导出肽序列。 2.质谱与核酸研究 现代质谱技术自诞生以来在多肽及蛋白质的研究中获得了极大的成功，于是人们 开始偿试着特质谱技术用于核酸的研究工作，近年来合成寡核苷酸及其类似物作 为反义治疗剂在病毒感染和一些癌症的治疗方面有着良好的前景，寡核苷酸作为 药物其结构特征必须进行确证。常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行 分析，而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。 ESI 和 MALDI 质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强 有力的方法，它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从 3或 5端进行部分降解， 在不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号， 通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，可以计算出被切割的核苷酸单体分子质 量，将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照，就可以读出寡核苷酸的序列。 由于 MALDI 技术分辨率的问题，使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。 如何获得高分辨率的 DNA 质谱图一时间成为了研究的热点问题，由于 DNA 的化 学结构存在着不同于蛋白质的结构特征，使得 DNA 样品存在某些特殊性，一是其 结构中存在着磷酸基团，有形成钠磷化合离子的趋势；二是在激光解吸离子化过 程中它的结构不如蛋白质稳定，易形成碎片，这导致峰宽和分子离子的强度变弱， 从而使得分辨率下降。 1995 年，MLVestal 等把离子延迟引出（lonDelayed Extraction, DE）技 术应用于 MALDIMS 中，不但提高了 MALDIMS 的分辨率，而且也开创了质谱应 用于 DNA 研究领域的新局面。国内邓慧敏等也应用 DEMALDI-MS 法测定了混合碱 基 DNA，获得了高分辨率的 DNA 质谱图。 质谱与临床医学。除了应用于蛋白质和核酸研究以外，质谱还以其灵敏度和高 分辨率在临床医学检直中得到了广泛的应用，如对药物代谢产物的动态分析，癌 细胞蛋白质的鉴定，同位素标记物的检测等。其中用同位素 14C 标记的 14C-尿素 呼吸试验和 15N 标记的 15N-排泄试验已成为临床检测胃幽门螺杆菌（HP）的有效 手段。 随着生物工程技术的发展，大量的生物工程产品不断出现，传统的测定分子量 及纯度的方法已不能担当此重任，现在人们把 MALDI-TOF-MS 应用于此领域，得到 了很好的效果。蔡耘等用上述技术对重组的人表皮生长因子（hEGF）白细胞介素- 3（IL3）、肿瘤坏死因子（TNF）粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMC