碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究

碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究 董静董静 201131301031201131301031 摘摘 要：要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定 AKP 的作 用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有 AKP 的滤液用 冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据 AKP 在 33的丙酮或 30的乙醇中溶解，而在 50的丙酮或 60的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有 AKP 的滤液中获得较为纯净的 碱性磷酸酶。酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适 PH 值为 10.0，最适温度为 37, 米氏常数值 Km 为 3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在 pH 在 8-9 区间和温度在 25-37区间下 稳定。 关键字：关键字：碱性磷酸酶 分离纯化 热稳定性 酸碱稳定性 碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3131，简称 AKP)广泛存在于 微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物 质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。此外，通过催化磷蛋白的水解， 碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。它可专一性的水解磷酸单酯 化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的 重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。药用化妆品中添加碱 性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。 它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程 1。临床上通过测定 AKP 的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。 因此纯化和研究 AKP 的性质、调控等有重要意义。本实验尝试以猪肝为材料， 分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性 磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。 此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料2-3。 研究酶的生物学特性，其之一是它对酸碱度的敏感性， pH 对酶活性的影响 极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的 pH 条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的 pH 值称为酶的最适 pH。pH 不仅对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响，而且对酶的稳 定性也有很大的影响。因为该酶的化学本质是蛋白质，同蛋白质容易变性一样， 酶在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。各种酶的酸碱度稳定范围是不同 的，这就需要制作酸碱稳定性曲线4。 对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。酶反应速度达到最大值时的温度 称为酶的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度条件 下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标，可得到一条温度酶 活性曲线。酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，这就需要通过热稳定 性试验测出热稳定范围。一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度 下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温 度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定性曲线，根据这条 曲线即可求出酶的热稳定性范围5。 抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。它与酶的活性部位结 合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降，这里不包括酶蛋 白的水解或变性等情况。在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相 互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。在竞争性 抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成 EIS，其动力学特征是： 米氏常数的表观值 Km 增加，酶的最大反应速度 Vm 不变。在非竞争性抑制中， 抑制剂、底物都能同时和酶结合形成 EIS，但是 EIS 不能进一步转变为产物， 其动力学特征是：Vm 降低而 Km 不变。在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和 底物结合以后才能和酶结合形成 EIS，即 Ki=，其动力学特征是：Km 和 Vm 都 发生了变化6。 1 1 材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.11.1.1 原料原料 菜市场购买的新鲜猪肝，由本实验室保存。 1.1.21.1.2 主要仪器主要仪器 移液管；量筒；玻璃勺浆器(管)；剪刀；离心机（湘仪 Cence H2050R）为 湖南湘仪实验室仪器开发有限公产品；新华定性滤纸；HH 数显恒温水浴锅为金 坛市金城国胜实验仪器产品；721 型分光光度计 （UNIC7200 SPECTROPHOTOMETER）为国产分光光度计。 1.1.31.1.3 试剂试剂 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000ml;0.1mol/L 酸钠溶液:8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000ml;0.01mol/L 醋酸镁-0.0lmol/L 醋酸钠溶液:准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸镁溶 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混合后定容至 1000ml；tris-hcl ph8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g，用蒸馏水溶解后定容至 1000ml，即为 0.1mol/LTris 溶液.取 100ml10.1mol/LTris 溶液，加蒸馏水约 780mL，再加 0.1mol/L 醋酸镁溶液 100ml，混匀后用 1%冰醋酸调 ph 为 8.8，用 蒸馏水定容至 1000ml；正丁醇、丙酮、95%乙醇；0.04mol/l 作用物液：称 取 10.16g 磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至 1000ml，加 4ml 氯仿防腐，贮于棕色瓶子内，置冰箱内保存；0.1mol/l 碳酸盐缓冲液 （ph10.0）：称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g 溶解于蒸馏水中，并稀 释至 1000ml；碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶 5mg，用 ph10 缓冲液配制 成 100ml，放置冰箱内保存;0.5mol/lNaOH 溶液;100.3%4-氨基安替比林:称取 3g4-氨替比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水溶解，并稀释至 1000ml，贮于棕色瓶 中，放冰箱内保存； 0.5%铁氰化钾：称取 10g 铁氰化钾及 30g 硼酸各溶于 11 800ml 蒸馏水中，溶解后两液混合加水至 2000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存； 基质液：称取磷酸苯二钠2H2O6g,4-氨基安替比林 3g，分别溶于煮沸冷却后 12 的蒸馏水中，两液混合并稀释至 1000ml，加 4ml 氯仿防腐，于棕色瓶内，用时 与等量的水混合即可;各 ph 值相应缓冲液，0.5mol/LKH2PO4：称取 1314 KH2PO46.80g，加水溶解并定容至 100ml；0.04M 磷酸氢二钠：称取磷酸氢二 15 钠 14.3g，溶解于 0.1MpH10 的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至 1000ml。 1.21.2 方法方法 1.2.11.2.1 提取方法提取方法 加 10ml 正丁醇，搅拌 3-5 分钟 后，四层纱布过滤后，离心 30min，2500r/min 加 23.5ml 冷丙酮（-10）混 匀，冰冻离心 2500 转 5 分钟 加 0.5moL/l 醋酸镁 20ml，量体 积为 29ml 加 96%乙醇 12,95ml 离心 3000 转 5 分钟 加 96%乙醇 27.9ml，离心 2500 转 5 分钟 0.01mol/L 醋酸镁-0.0lmol/L 醋酸钠 20ml 溶解，加 96%乙醇 9.75ml，离心 2500 转 5 分钟 加 96%乙醇 24.5ml，离心 2500 转 5 分钟 分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在 0-4进行） 取新鲜猪肝 10g 剪碎（0-4） 肝匀浆体积 32.5ml 滤液 23,5ml 上清液（弃去） 沉淀 悬液 沉淀（弃去） 上清液 33.5ml 上清液（弃去） 沉淀 沉淀（弃去） 上清液 29.5ml 加 0.01mol/L 醋酸镁- 0.0lmol/L 醋酸钠 60ml，在电 动匀浆上匀浆。 加 0.5mol/L 磷酸镁 15ml 溶解， 总体积 17.5ml，加 99.5%丙酮 16.4ml，离心 2500 转 5 分钟 加丙酮 7.65ml 至 50%，离心 4000 转 10 分钟 上清液（弃去） 沉淀 沉淀（弃去） 上清液 上清液（弃去） 沉淀：加 pH8.8Tris 缓冲液 10ml，分装保存，1ml1 管，在-20下保存 10 管。 1.2.21.2.2 KmKm 值测定方法值测定方法 取大试管 7 支，按表 1 分别加入相应试剂，加入酶液，混匀之后立即计 时，各管在 37水浴中准确保温 15 分钟后，立即加入 0.5molNaOH 液 1.0ml 以 终止反应；各管中加入 0.3%4-氨基安替比林 1.0ml 和 0.5%铁氰化钾 2.0ml， 充分混匀，放置 10 分钟，以 0 管为对照，在波长 510nm 下比色，记录各管的吸 光度；作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度 v，以之为纵轴，以作 用物浓度S为横轴，在坐标纸上连接各点作图，以观察曲线的形状。以各管吸 光度值的倒数为纵坐标轴，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求出此酶的 Km 值。 表 1 Km 值测定曲线制作 试剂管号 （ml） 12345670 0.04mol/L 作用物 液 0.150.200.250.300.400.600.800 pH10 磷酸缓冲液 0.900.900.900.900.900.900.900.90 蒸馏水 0.850.800.750.700.600.400.200 混匀 37 预热5 分 钟 酶液 0.10.10.10.10.10.10.10.1 1.2.31.2.3 最适最适 pHpH 及酸碱稳定性实验及酸碱稳定性实验 pH活性曲线的制作 取 6 支试管，按表 2 操作，以反应 pH 值为横坐标，A510为纵坐标绘制 pH 活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适 pH 值。 表 2 pH活性曲线制作 管号 123450 反应 pH 8910111210 相应 pH 缓冲液各加 0.5ml 酶液各加 0.1ml（0 号管酶液在铁氰化钾之后加） / 37预热 5 分钟 预热的基质液各加 3.0ml 37精确保温 15min 后各加 1,0ml 碱性溶液终止反应 0.5%铁氰化钾各加 2.0ml A510 酸碱稳定范围的测定 取 6 支试管，按表 3 操作，以 pH 为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定 曲线，并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。 表 3 酸碱稳定范围曲线的制作 管号 123450 处理 pH 8910111210 相应 pH 缓冲液各加 0.1ml 酶液各加 0.1ml 37保温处理 1h 0.1MPH10 碳酸盐缓冲液各加 0.5ml 预热的基质液各加 3.0ml（0 号管基质液在铁氰化钾之后加） 0.5%铁氰化钾各加 0.2ml A510 1.2.41.2.4 最适温度及热稳定性实验最适温度及热稳定性实验 温度活性曲线的制作 取 4 支试管，按表 4 操作，以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温 度活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。 表 4 温度活性曲线制作 管号 1230 反应温度（） 25378037 稀释酶液各加 0.1ml（0 号管在铁氰化钾之后加） 预热复合基质液各加 3.0ml 分别在不同温度下精确反应 15min，各加 1.0ml 碱性溶液终止反 应 各加 0.5%铁氰化钾 2.0ml，静置 10min A510 热稳定性测定 取 4 支试管，按表 5 操作，在上述相应温度的恒温水浴锅内放置相应时间 后取出，立即以流动水冷却并置于 37恒温水浴锅中预热 2 分钟，以处理温度 为横坐标，A510为纵坐标，绘制处理时间为 15min 的热稳定曲线，并分析在本 实验条件下碱性磷酸酶的热稳定范围。 表 5 热稳定范围曲线制作 管号 1230 热处理温度（） 25378025 热处理时间（分）各 15 酶液（ml）各加 0.1ml（0 号管在铁氰化钾之后加） 37预热的复合基质各加 3.0ml 37精确反应 15min 后各加 1,0ml 碱性溶液终止反应 0.5%铁氰化钾各加 0.2ml A510 1.2.51.2.5 抑制剂类型鉴别抑制剂类型鉴别 取 5 支试管，按表 6 操作，以反应速度倒数 1/V 或 1/ A510为纵坐标，以底 物浓度倒数 1/S为横坐标，作图，观察直线在纵轴和横轴上的交点位置并计 算其 K 值，与未加抑制时的 Km 值比较。说明该抑制剂属于何种类型。 表 6 抑制剂类型曲线制作 管号 12340 40mmol./L 底物浓度 0.100.150.200.300 碳酸盐缓冲液 0.90.90.90.90.9 蒸馏水 0.800.750.700.600.90 0.25MKH2PO40.10.10.10.10.1 混匀，37预热 5min 酶液 0.10.10.10.10.1 最终底物浓度（mmol/L） 0.10.10.10.10.1 按顺序各加 1.0ml 碱性溶液，1ml4-氨基安替比林，2ml 铁氰化 钾 A510 2.2. 结果与分析结果与分析 2.12.1 KmKm 值的测定值的测定 表 7 Km 值测定实验各管光吸收值 管号 12345670 0.04mol/L 作用物液 0.150.200.250.300.400.600.800 光吸收值 0.4120.4590.5350.5450.4440.4590.7010 -0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.30.4 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1/A510 图 1 Km 测定图 由图 1 可知，Km 值测定曲线 y=3.747 x+1.188,计算出 Km 值等于 3.154mmol/L 2.22.2 最适最适 pHpH 及酸碱稳定性实验及酸碱稳定性实验 2.2.12.2.1 pH-pH-活性曲线测定活性曲线测定 表 8 pH活性曲线制作 管号 123450 反应 pH 8910111210 A5100.0070.0110.0380.03600 012345678910111213 0 0.35 0.7 1.05 1.4 1.75 2.1 2.45 2.8 3.15 3.5 3.85 4.2 4.55 4.9 5.25 5.6 5.95 PH 图 2 pH-活性曲线 由上述数据和图 2 可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的的最适 pH 值为 10 2.2.22.2.2 酸碱稳定范围的测定酸碱稳定范围的测定 表 9 酸碱稳定范围曲线的制作 管号 123450 处理 pH 8910111210 A5100.1670.1710.1310.01900 024681012 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 PH A510 图 3 酸碱稳定范围曲线 由上述数据和图 3 可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的酸碱稳定范围为 pH 值 8-9，在 pH 值为 9 时最为稳定。在高 PH 下酶的活力受到很大的影响，曲线呈下 降趋势。 2.32.3 最适温度及热稳定性实验最适温度及热稳定性实验 2.3.12.3.1 温度温度活性曲线活性曲线 表 10 温度活性曲线制作 管号 1230 反应温度 25378037 A5100.1710.2120.0340 0102030405060708090 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 T A510 图 4 温度-活性曲线 由上述数据与图 4 可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度为 37，温度 为 80高温时，酶部分失活，曲线下降。 2.3.22.3.2 热稳定性测定热稳定性测定 表 11 热稳定范围曲线制作 管号 1230 热处理温度 25378025 A5100.2140.20300 0102030405060708090 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 T A510 图 5 热稳定范围曲线 由上述表中数据与图 5 可知，碱性磷酸酶在本实验条件下的热稳定范围为 25 -37之间，在 37时最为稳定，酶活最高，在高温情况下酶不稳定，部分失 活，曲线快速下降。 2.42.4 抑制剂类型鉴别抑制剂类型鉴别 表 12 抑制剂类型曲线制作 管号 123450 最终底物 浓度 2468160 A5100.2530.2870.4030.4940.3960 -0.6-0.4-0.200.20.40.6 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 1/S 1/A510 图 6 抑制剂类型曲线 由图 6 可知，抑制剂 Km 值测定曲线 y=4.111x+1.985，计算 Km 值等, 2.071mmol/L，与未加抑制剂时的 Km 值相比较，表明该抑制剂属于反竞争性抑 制。 3.3. 结论与讨论结论与讨论 3.13.1 结论结论 通过本实验，可知碱性磷酸酶在本次的实验条件下 Km 值为 3.154，最适 pH 值为 10，在本实验条件下的酸碱稳定范围为 pH 值 8-9，在 pH 值为 9 时最为稳 定。在高 PH 下酶的活力受到很大的影响。 在本实验条件下碱性磷酸酶的最适温度为 37，温度为 80高温时，酶失 活，酶活下降直至 0，碱性磷酸酶在本实验条件下的热稳定范围为 25-37之 间，在 37时最为稳定，酶活最高，在低于最适温度时，酶活很低，随温度的 升高酶活随之上升，直到最适温度达到最大，在高温情况下酶不稳定，部分失 活，曲线快速下降。 此次实验采用的抑制剂类型属于反竞争性抑制。 3.23.2 讨论讨论 此次试验过程中，我们严格按照实验室原则与规范的实验步骤进行操作， 纯化后的碱性磷酸酶浓度很高，在后面测定酶学性质过程没有稀释到合适的浓 度，导致第一次测出来的吸