电泳技术研究进展

电泳技术研究进展电泳技术研究进展 学生：张丽丽 学号：2011103043 指导老师:何大俊老师 摘要：电泳技术是一种先进的检测手段，与其它先进技术相配合，能创造出惊人的成果， 可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和 疾病等一系列迫切问题，都有积极作用，显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多 地为人们所重视,广泛应用于各个领域 关键词：电泳技术；发展；应用；前景 1809 年俄国物理学家 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管 的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒 向正极移动，这就是电泳现象。1909 年 Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电 泳。他用不同 pH 的溶液在 U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937 年瑞典 Uppsala 大学的 Tiselius 对电泳仪器作了改进，创造了 Tiselius 电泳仪，建 立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及 、 球蛋白 组成的，由于 Tiselius 在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了 1948 年的诺贝尔化学 奖。1948 年 Wieland 和 Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸 的分离进行过研究。从本世纪 50 年代起，特别是 1950 年 Durrum 用纸电泳进行了各种 蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、 淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959 年 Raymond 和 Weintraub 利用人工 合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率， 开创了近代电泳的新时代。30 多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中 对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生 化物质的最高纯度：即“电泳纯” （一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方 法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check” 。由 80 年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要 新发展，己受到人们的充分重视。 2.电泳的原理 在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤 纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子 物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、 分析， 但目前则一般使用更灵敏的技术如 HPLC 等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物 质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引 入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手 段之一。 最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白 质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场， 驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的 一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板， 玻 璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是 12cm 14 cm，厚度为 1mm2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短 电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。 水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液， 或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于 pH 值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其 电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的 带电性质的稳定。为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍 一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V） ，就会在电极中间产生电场强 度（E） ，上式中 L 是电极间距离。 在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F） ，等于所带净电荷与电场强度的乘积： F = q E 上式中 q 是带电分子的净电荷，E 是电场强度。 这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到 介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F ）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲 液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F的大小服从 Stokes 定律，即：F=6r 式中 r 是球状分子的半径， 是缓冲液粘度， 是电泳速度(= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F ， qE = 6r 电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度：LVE =电泳是指 带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白 质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的 pH 值下可以带正电或负电， 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术 就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状 等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技 术。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius 等在 1937 年进行的自由界面电泳没 有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的 电泳，所以：这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比， 与分子的 大小和缓冲液的粘度成反比。用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使 用的是相对迁移率 m R。即：上式中：d带电粒子泳动的距离，t电泳的时间，V电 压，L两电极交界面之间的距离，即凝胶的有效长度。 因此，相对迁移率 m R 就是两 种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因 而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分 子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度 也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不 同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程 中产生的阻力不同而得到分离，如 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方 法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。 3.电泳技术的分类 3.1 电泳按其分离的原理不同可分为： 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带， 这是当前应用最为广泛的电泳技术。 自由界面电泳：这是瑞典 Uppsala 大学的著名科学家 Tiselius 最早建立的电泳技术， 是在形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。 等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面， 并以等速向前运动。 等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成 pH 梯度，当被分离的生物大分子移 动到各自等电点的 pH 处聚集成很窄的区带。 3.2 按支持介质的不同可分为： 纸电泳（Paper electrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis） 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis） （PAGE） SDS聚丙烯酰 胺凝胶电泳（SDSPAGE） 。 3.3 按支持介质形状不同可它为： 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳。 3.4 按用途不同可分为： 分析电泳； 制备电泳； 定量免疫电泳； 连续制备电泳。 按所用电压不同可分为： 低压电泳：100V500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳：1000V5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、 核苷酸和糖类等小分子物质的分离。 4.电泳技术的应用 随着新的电泳技术的出现,各种自动化电泳分析仪问世并相继被引入临床实验室,电泳技 术在临床疾病的诊断中正发挥越来越多的作用,特别是为各种体液蛋白质、同工酶等的检测 提供了新的手段。 血清蛋白电泳:新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后,常见白蛋白、 1、2、 和 球蛋白 5 条带。血清蛋白质电冰图谱是了解患者血清蛋白质全貌的有价值 的方法,可用为初筛试验。急性炎症或急性时相反应时常以 1、2 区带加深为特征;妊娠型 1 区带增高,伴有 区带增高;肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降,1、 球蛋 白升高;缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现 区带增高,而慢性肝病或肝硬化呈现白 蛋白显著降低, 球蛋白升高 23 倍,示免疫球蛋白( Ig)多克隆高,甚至可见 桥,还可在 区呈现细而密的寡克隆区带;单克隆 Ig 异常症(M 蛋白血症)则在电冰区带 区呈现致密 而深染,高度集中的蛋白克隆增生区带(M 蛋白区带) 。 4.1 尿蛋白电泳 尿蛋白电泳的主要目的是在无损伤的情况下,协助临床判断肾脏病变的严重程度。当 不能进行肾活检时,尿蛋白电泳结果能很好地协助临床判断肾脏的主要损害。尿蛋白电泳后 呈现出中、高分子蛋白区带主要反映肾小球病变,呈现出低分子蛋白区带可见于肾小管病变 或溢出性蛋白尿(如本周蛋白) ;混合性蛋白尿可见到各种分子量区带,示肾小球和肾小管均 受累及。对临床症状不典型的患者及微量蛋白尿患者的诊断及各种肾脏疾病治疗过程中病 情的动态分析也具有很大价值。 4.2 脑脊液蛋白电泳 若在脑脊液(CSF)标本中检出寡克隆区带,而其相应血标本中未能检出区带,反映是由 中枢神经系统本身合成的 Ig,具有重要临床意义。但为保证正确的比较与分析,须将患者血 清和 CSF 在同一天同步进行分析,以论证不同来源的 Ig。中枢合成 Ig 是中枢神经系统疾患 的一个重要信号,主要用于多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、亚急性脑白质炎、神经性梅毒等 中枢神经系统疾患的诊断和鉴别诊断。 4.3 血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重 大意义。HbA2 增高是 2 轻型地中海贫血的一个重要特征, HbA2 减低见于缺铁性贫血及 其他 Hb 合成障碍性疾病(常见如 2 地中海贫血) 。电泳发现异常 Hb 如 HbC、HbD、HbE、HbK 和 HbS 等则可诊断为相应的 Hb 分子病。在酸性条件下电泳,可将糖化 血红蛋白的不同组分 HbA1 a, HbA1 b 和 HbA1 c 分离开来, HbA1 c 形成与 RBC 内葡萄糖有 关,可特异性反映测定前 6 8 周体内葡萄糖水平。此外,糖化血红蛋白可对某些患者因 HbF 增高所造成 HbA1 c 假性升高作出解释。 4.4 免疫固定电泳 可对各类 Ig 及其轻链进行分型,最常用于临床常规 M 蛋白的分型与鉴定。一般用于单 克隆 Ig 增殖病、单克隆 Ig 病、本周蛋白和游离轻链病、多组分单克隆 Ig 病、重链病、 CSF 寡克隆蛋白鉴别、多克隆 Ig 病的诊断和鉴别诊断。 4.5 同工酶电泳 临床上用于同工酶或同工酶亚型分析。(1)乳酸脱氢酶(LD /LDH)同工酶:用琼脂糖凝胶 电泳(AGE)法可分离出 5 种同工酶区带(LD1 LD5 ) 。主要用于急性心肌梗死(LD1 LD2 ) 及骨骼肌疾病(LD5 升高)的诊断和鉴别诊断。恶性肿瘤、肝硬化时可见 LD5 明显升高,或 在胸腹水中出现一条异常 LD6 区带。(2)肌酸激酶(CK)同工酶:采用 AGE 法可分离出 3 种 CK 同工酶。当出现异常同工酶如巨肌酸激酶 1 (CK1 ) 、巨 CK2 等时,从电泳图谱上很容易发 现。CK2MB 在心肌梗死早期增加和短时间内达峰值也是心肌再灌注的指征。CK2BB 增高见于 脑胶质细胞瘤、小细胞肺癌和胃肠道恶性肿瘤,后者还常有 CK2Mt 增高。 (3) CK 同工酶亚 型:指 CK2MM 亚型(CK2MM1、CK2MM2、CK2MM3 )和 CK2MB 亚型(CK2MB1、CK2MB2 ) ,常采用琼 脂糖凝胶 IEF 或高压电泳。采用琼脂糖凝胶高压电泳可进行 CK 同工酶亚型的常规快速分析,用 于临床早期心肌损伤的临床诊断与鉴别诊断。主要用于急性心肌梗死的早期诊断,也可用于 确定心肌再灌注、溶栓治疗后的病情观察。(4)碱性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用 AGE 法进行 ALP 同工酶的常规快速分析。肝外阻塞性黄疸、转移性肝癌、肝脓疡和胆石症时胆汁 ALP 检出率很高,并伴有肝 ALP 增加,而肝内胆汁淤积、急性肝炎、原发性肝癌等主要表现为肝 ALP 增多,大多数不出现胆汁 ALP。甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、骨折、肢端肥大症所致骨 损伤等,均引起骨 ALP 同工酶增加。骨 ALP、高分子 ALP 同工酶对恶性肿瘤骨转移或肝转移 的阳性预示值较总 ALP 高。胃肠道肿瘤、肺癌等恶性肿瘤时出现类肠型 ALP。(5)2 谷氨 酰转肽酶(2GT/GGT)同工酶:用 CAE 或 AGE 法可将 2GT 同工酶分离为 2GT1 2GT4 ,正 常人只见 2GT2 和 2GT3 ,重症肝胆疾病和肝癌时常有 2GT1 出现,2GT4 与胆红素 增高密切相关。 4.6 脂蛋白电泳 脂蛋白电泳检测各种脂蛋白(包括胆固醇和 TG)主要用于高脂血症的分型、冠心病危险 性估计,以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗(包括治疗性生活方式 改变、饮食及调脂药物治疗)效果观察的研究等。 4.7 电泳技术在农林生化领域的应用 利用毛细管电泳芯片可以进行 DNA 长度、序列和基因分析型等分析。在临床检测，尤其 是在遗传病的诊所中具有重要的意义。现在分离 DNA，是利用芯片分离荧光标记的寡核苷 酸，整个分离过程在 45 S 之内，而芯片的长度仅为 3.18CM。目前在我国已有少数医院开 始采用 8 通道的 DNA 测序，系统的开展用拉米夫治疗乙型肝炎病毒的 YMDD 突变检测。随着 人类基因组计划的完成，后基因组时代已经到来，蛋白质组学的研究现在已经成为医学， 生物学，农业等领域的研究热点。目前转基因技术一方面对农业生产的提高有着无可争议 的作用，另一方面也给公众带来了关于食品安全的疑问。转基因食品的成分是否改变及其 食用是否安全一直是科学研究的热点。双向电泳技术能及时检测转基因后诱导的新蛋白表 达变化，根据蛋白质表达差异级转基因后诱导的新蛋白来里了解它们对转基因食品的安全