福建农林大学分子生物学教案

教教 案案 20 05 20 06 学年 第 一 学期 学 院、 系 室 生命科学学院 生物技术系 课 程 名 称 生物化学与分子生物学实验 专业、年级、班级 2002 级生物科学、生物技术 2003 级生物技术（专升本） 主 讲 教 师 甘纯玑、李今煜、谢苗、沙莉 2 实验 酵母的提取与分离 实验 大蒜细胞的提取与分离 实验 SDS-PAGE电泳 实验 凝胶排阻层析 实验 多糖的水解及水解物的薄层层析测定 实验 菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定 实验 质粒 DNA 的提取及酶切 实验 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 实验 PCR 基因扩增 实验 探针制备 实验 Southern 杂交 3 福 建 农 林 大 学 教案编写说明 教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标， 以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个 章、节或主题的全部教学活动。教案可以按每堂课（指同一主题连续 14 节课）设计编写。教案编写说明 如下： 1、编号：按施教的顺序标明序号。 2、教学课型表示所授课程的类型，请在理论课、实验课、习题课、实践课及其它栏内选择打“” 。 3、题目：标明章、节或主题。 4、教学内容：是授课的核心。将授课的内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*” 、 “#” “？”符 号分别表示重点、难点或疑点。 5、教学方式、手段既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。教学媒介指教科书、板书、多媒体、模型、 标本、挂图、音像等教学工具。 6、讨论、思考题和作业：提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成， 以供考核之用。 7、参考书目：列出参考书籍、有关资料。 8、日期的填写系指本堂课授课的时间。 4 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 理论讲授、学生预习实验、实验预习报告面批 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握实验准备的基本步骤 熟悉实验操作步骤 掌握实验中需要溶液的配制 熟悉实验内容 教学内容（注明：*重点 # 难点 ？疑点）： （*）实验室规则实验室安全及防护知识（*）实验预习、实验记录与实验报告 实验室基本操作（#）缓冲溶液与 pH 测定生化实验室的基本设施与装备 5 教学方式、手段、媒介： 讲授 板书设计： 1.1 实验室规则 1.2 实验预习、实验记录与实验报告格式 1.3 实验室安全及防护知识 1.4 缓冲溶液与 pH 测定 1.5 实验室基本操作 1.6 生物化学与分子生物学实验室的基本设施介绍 讨论、思考题、作业： 预习下周安排的实验 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 11 月 05 日 6 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 酵母的提取与分离 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握冷冻离心机的使用 掌握缓冲液的配制 熟悉 RNA 的特性反应及苯酚乙醇提取法 做好实验记录 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理 酵母细胞置于含有的缓冲液中，加等体积的苯酚水溶液，通过激烈振荡一段时间，将 和蛋白质分开，然后离心分层，溶于上层水溶液中，和蛋白质在酚层，可用乙醇沉 淀析出。 步骤 1、取新鲜湿酶母或 8g 干酵母，加入 50一缓冲液，再加入 75 苯酚水溶液，在室温下激烈振荡，然后冷却至，以下操作均在进行。 2、上述提取液以离心，分离出上层水相，加入体积的乙酸 钾溶液，再加入倍体积的乙醇。在一左右放置使沉淀析出。此沉淀可在冰箱中 （）长期保存。亦可将沉淀以离心 10 ，取沉淀用少许乙 醇、醇和无水乙醇各离心洗涤一次，然后将沉淀溶于少量溶液中， 保存备用(或真空干燥)。 3、含量测定 教学方式、手段、媒介： 实验讲授、操作示范、指导 7 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 8 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 大蒜细胞的提取与分离 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握冷冻离心机的使用 掌握缓冲液的配制 掌握研磨等基本操作 熟悉 SOD 酶的一种提取法 做好实验记录 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理： 超氧化物歧化酶（）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负 离子（）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢： 。大蒜蒜瓣和 悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的，通过组织或细胞破碎后，可用.磷酸缓冲液提取。 由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 步骤： 1、组织或细胞破碎 称取左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。 2、的提取 将上述破碎的组织或细胞，加入倍体积的 0.05mol，7.8 的磷酸缓冲液，继续研磨 搅拌 20min，使充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在 5000min 下，离心 15min，弃沉淀， 得提取液。 3、除杂蛋白 提取液加入 0.25 倍体积的氯仿乙醇混合溶剂搅拌 15min，5000r/min 离心 15min，去 杂蛋白 沉淀，得粗酶液。 4、的沉淀分离 将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min， 5000 rmin 离心 15min，得沉淀。 将沉淀溶于 0.05mol，p7.8 的磷酸缓冲液中，于 5560热处理 15min，离 心弃 沉淀，得到酶液。 将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的活力。 5、活力测定 取根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。 试 剂 空白管 对照管 样品管 碳酸缓冲液 溶液 蒸 馏 水 9 样 品 液 混 合 均 匀 肾上腺素液 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在水浴中预热至恒温。加入肾上腺素（空白管不加） ，继续保温反应 ，然后立即测定各管在处的光密度。对照管与样品 管的光密度值 分别为和。 在上述条件下，抑制肾上腺素自氧化的所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 酶活力（单位） (AB)N/A 式中 N样品稀释倍数; 抑制肾上腺素自氧化的换算系数（100 / 50） 。 若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算 酶活力单位/ml= 2(AB)N/AV/V1=26(AB)N/A 式中 V反应液体积（6.); V1样品液体积（0.） 。 最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化过程收率。 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 10 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 SDS-PAGE电泳 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握 SDS-PAGE 的操作 掌握电泳测定蛋白质分子量的方法 掌握凝胶电泳中各种试剂的作用 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理： SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它 们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样 （约为 18，即 1.8nm） ，而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的 SDS-蛋白质复合物，在凝胶 电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函 数。 由于 SDS 和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果 只是亚基或单条肽链的分子量。 操作过程： 1、准备步骤 1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。 2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。 3）灭菌枪头、eppendorf 管。 2、制备凝胶 1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以 5%琼脂封底。 2）配制 10%的分离胶（20ml）：依次将 8ml 蒸馏水，6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液，5ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液，0.2ml 10% SDS 溶液，0.2ml 10%过硫酸铵，0.008mlTEMED 混合，立即灌胶。 3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多 1cm。小心在胶上覆盖一薄层正 丁醇。 4）在分离胶聚合的过程（约 40 分钟）中，配制 5%的积层胶（8ml）：依次混合 5.5ml 蒸馏水，1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液，0.08ml 10% SDS 溶液，0.08ml 10%过硫酸铵， 0.008TEMED。TEMED 应在灌胶前才加入应在灌胶前才加入。 5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。 6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。 11 7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙 烯酰胺。 8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。 3、样品的制备 在蛋白溶液中加入等体积的 2样品溶解液，使蛋白的终浓度为 3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热 3 分钟，冷却后即可上样。 4、上样 用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体 积的 SDS 样品溶解液。 5、电泳 装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为 100-120V，当染料进入分离胶（这段时间约为 20min）后， 将电压提高到 200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部 1cm 处。 6、后处理 1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液 （固定液的量至少为胶体积的 5 倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。 2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上） ，室温染色 8 小时或 60染色 2 小时。 3）脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液 3-4 次。 结果结果 绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。 注意事项注意事项 N,N-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要 时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 12 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 凝胶排阻层析 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 通过杂蛋白的分离，学习分子筛层析的基本原理及操作方法。 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理： 凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography） 、 分子筛层析（molecular sieve chromatography） 、凝胶过滤（gel filtration） 、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中 各个组分的液相色谱方法。一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时 进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝 胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗 粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶 内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分 子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫 分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小 极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔 隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一 定的分子筛有它一定的使用范围。 操作过程： 1凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮 ，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌 ，静置 20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。 2装柱 纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25100 倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些 ，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细 ，会发生“器壁效应” ，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度 应有一定的比例。对于除盐来说应为 15125；对于纯化蛋白质来说应为 1201100。 将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（ 0.5N1N） 、碱 （0.5N1N） 、盐（0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然 13 后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起） ，以除去其内部的气泡 。 关闭层析柱出水口，并装入 1/3 柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约 3 cm 高。 打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。注意不能干柱、分层，否 则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有 23cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。 3.平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的 pH 和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走 柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同） 。平衡液体积一般为 35 倍柱床体积，以保证平衡后柱床 体积稳定及基质充分平衡。 4加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的 15%，最多不要超过 10%。样品浓度也不宜过大，浓度过 大粘度大，分离效果差，一般不超过 4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离 子强度和 pH 值。分离血清蛋白常用 0.020.1Mol/L pH 6.98.0 的 PBS 液（0.14Mol/L NaCl）和 0.1Mo l/L pH8.0Tris-HCl 缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl） 。 5洗脱液收集 由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多， 一般 1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至 0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并 一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 14 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 多糖的水解及水解物的薄层层析测定 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 通过氨基酸的分离，学习薄层层析法的基本原理及操作方法。 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理： 多糖是生物体的重要组成成分，是由各种糖单元组成的大分子化合物。在酸或酶的作用下，最终可 水解成单糖。由于硅胶对各种单糖的吸附力不同，所以用硅胶制备的薄层层析板可以对单糖混合液进行 分离。 操作过程： （）样品水解 取样品 10mg，放入 10ml 胶木螺口离心管中，在冰水浴上冷却，加入 0.1ml 80%硫酸溶液，旋紧螺口盖， 于室温下水解 18h。再于冷水浴中冷却，加入 1.3ml 蒸馏水，使硫酸的浓度为 1mol/L，旋紧螺口盖，于 沸水浴中加热水解 5 小时。室温冷却，开管。用稍过量的碳酸钙粉末中和，于 4000 转/min 下离心沉淀 5min。移取 200l 清液，置离心管中，于离心真空干燥器中干燥，备用。点样前加 0.1ml 蒸 馏水，将干燥的样品溶解。 （）点样 将样品分别点在经活化的薄层层析板上，点样量约，分次滴加，使点扩散后的直径不超 过 3。 （）展层 将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中，用新配制的展开剂，采用上行法展层，至展开剂距薄层板 的上端约cm 时取出，用吹风机吹干。 （）显色 采用苯胺二苯胺磷酸（2g 二苯胺，加 2ml 苯胺，10ml 85%磷酸，1ml 浓盐酸，100ml 丙酮，溶 解后混匀）显色剂丙酮溶液喷雾法显色，然后于烘箱中烘分钟，各种糖即呈现出不同的颜色。 （）结果计算 小心量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的值。根据标准糖的颜色和值， 鉴定出样品中糖的种类，并绘出层析图谱。 原点至斑点中心的距离 15 。 原点至展开剂前沿的距离 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：李今煜 谢苗 沙莉 职称：讲师 助教 助教 2004 年 月 日 16 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：8 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和、的定性检定。 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 原理： 用冰冷的稀三氯醋酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质；再用有机溶 剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液（氯化钠溶液）和 0. 5mol/L 高氯酸（）分别提取和，再进行定性检定。 由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含 的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用定糖法来定性定量测定核酸。 核糖的测定： 测定核酸的常用方法是苔黑酚 （ 即：，二羟甲苯 ）法（Orcinol 反应） 。当含有核糖的 与浓盐酸及， 二羟甲苯在沸水浴中加热分钟后，有绿色物产生，这是因为 脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与，二羟甲苯作用产生绿色物质。 100 浓盐酸二羟甲苯 绿色复合物 FeCl3 、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。 脱氧核糖的测定： 测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中 共热分钟后，产生蓝色。这是因为嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成 羟基酮基 戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。 100 少量浓24二苯胺 蓝色物 此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。 上述两种定糖的方法准确性差，但快速简便，能鉴别与，是检定核酸、核苷酸的常 用方法。 操作过程： 一、核酸的分离： 取菜花的花冠 20 克，剪碎后置于研钵中。加入 20 毫升乙醇和毫克海砂，研磨 18 成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。 滤渣中加入毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。 再向滤渣中加入毫升丙酮，搅拌分钟后抽干（用力挤压滤渣，尽量除去丙酮） 。 在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的毫升高氯酸溶液中。搅拌抽滤，弃去滤液。 将滤渣悬浮于毫升乙醇中，抽滤，弃去滤液。 滤渣中加入毫升丙酮，搅拌分钟。抽滤至干，用力挤压滤渣尽量除去丙酮。 将干燥的滤渣重新悬浮在毫升氯化钠溶液中。在沸水浴中加热分钟。放置， 冷却，抽滤至干，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。 将滤渣重新悬浮在毫升mol/L 高氯酸溶液中。 加热到，保温分钟(恒 温水浴)后抽滤。留滤液(提取物二)。 二、的定性检定： 二苯胺反应： 管 号 蒸馏水（毫升） 溶液（毫升） 溶液（毫升） 提取物一（毫升） 提取物二（毫升） 二苯胺试剂（毫升） 放沸水浴中分钟后的现象 苔黑酚反应： 管 号 蒸馏水（毫升） 溶液（毫升） 溶液（毫升） 提取物一（毫升） 提取物二（毫升） 三氯化铁浓盐酸溶液（毫升） 2 苔黑酚乙醇溶液（毫升） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 放沸水浴中 10-20 分钟后的现象 根据现象分析提取物一和提取物二主要含有什么物质。 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 19 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 20 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 质粒 DNA 的提取及酶切 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握碱裂解法提取 E.coli 质粒的原理 熟练掌握碱裂解法操作的步骤方法 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 重点：重点：碱裂解法的原理 难点：难点：移液枪的正确使用、实验操作过程中避免杂质污 原理： 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。 在 pH 值介于 12.012.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件 下，共价闭合环状质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持 在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么 迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 提取质粒过程： 将 2ml 含相应抗生素的 LB 液体培养基加入到试管中，接入上述的含 pUC19 质粒的大肠杆菌，37振 荡培养过夜。 取 1.5ml 培养物倒入微量离心管中，12000r/min 离心 30sec。 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于 100L 溶液 I 中，剧烈振荡。 加 200L 溶液 II（新鲜配制） ，盖紧管皿，快速颠倒 5 次，混匀内容物，将离心管放在冰上。 加入 150L 溶液 III（冰上预冷） ，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置 1min。 12000r/min，离心 1min，将上清夜转至另一离心管中。 向上清夜加入 2 倍体积乙醇，混匀后，室温放置 510min。12000r/min 离心 5min。倒去上清夜，把离心 管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 用 1ml 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 10、50LTE 缓冲液，其中含有 20g/ml 的胰 RNA 酶，使 DNA 完全溶解，-20保存。 酶切反应(按顺序依次加入各种组分，尽量在冰盒上操作) 反应体系的建立（10L） 提取的质粒 2L 21 buffer 1L EcoRI 0.5L 水 6.5L 教学方式、手段、媒介： 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 22 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术。 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 重点：琼脂糖电泳技术检测 DNA 的原理 难点：操作中，学生要注意安全问题，避免与致癌物质 EB 接触 原理： DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子的高于等电点的 pH 溶液中 带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具 有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移 速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动 速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅 可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。如上次实 验提取的 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA（covalently closed circular DNA, 简称 CCCDNA） ，开环质粒 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA 1 条链断裂（open circular DNA ,简称 OCDNA） ，线状质粒 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA2 条链发生断裂（linear DNA, 简称 L DNA） 。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动 最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 实验步骤： 制备琼脂糖凝胶 加样 电泳 结果观察 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 23 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：甘纯玑 李今煜 谢苗 沙莉 职称：教授 讲师 讲师 助教 2005 年 月 日 24 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：6 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： DNA 实验 PCR 基因扩增 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握 PCR 反应的基本原理 掌握 PCR 仪的操作使用 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 重点：PCR 反应的基本原理 难点：PCR 反应体系中多种组分的作用 实验原理讲解： 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在待扩增 的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增 2n倍。典型的 PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的 DNA 引物、耐热 Taq 聚合酶。 实验步骤： 在 0.5ml Eppendorf 管内配制 25L 反应体系： 反应物体积/L 10buffer2.0 引物 11.0 引物 21.0 dNTP1.0 Taq 酶0.5 Template 1 ddH2O13.5 石蜡油20 按下列程序进行扩增： 、95预变性5min 、95变性1min 、55退火2min 、72延伸3min 、重复步骤30 次； 、72延伸10min 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果 25 配制 0.7%琼脂糖凝胶，取 10L 扩增产物电泳。保持电流 40mA。电泳结束后，用 EB 染色 15min，紫 外灯下观察结果。 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：李今煜 谢苗 沙莉 职称：讲师 助教 助教 2004 年 月 日 26 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：4 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 探针制备 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 掌握地高辛标记探针的制备方法 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 重点：探针制备的方法步骤 难点：DIG 标记的原理 实验原理讲解： 探针实际是已知的基因片段，应该该片段与待测样品杂交，如果靶基因和探针的核苷酸序列互 补，就可以根据碱基配对的原则进行核酸分子杂交，从而达到检测的目的。地高辛标记探针利用偶联抗 体或抗生物素蛋白的磷酸酯酶检测经修饰的碱基，用氮蓝四唑（Nitro blue tetrazolium, NBT）显色，氮 蓝四唑转变为不溶于水的有色物质，沉淀在杂交的原位。采用随机引物法筛标记反应液，以随机合成的 六聚体核苷酸（hexanucleotiide）为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 DIG-11-dUTP 为合成底物， 单链 DNA 为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成渗入 DIG 的 DNA 链。 地高辛标记属高效标记反应，以 1g DNA 探针为例，1h 反应可产生 0.8g 标记探针，20h 可产 生 2g 探针。同时，该标记方法操作简单，适用于含量 10ng-3g ，片段大小 100bp-10kb，线性或高 度卷曲 DNA 探针制备。 实验步骤： 1、 用超纯水稀释 1g DNA 至总体积 16g 。 2、 DNA 热变性：将 DNA 置沸水中，水浴 10min，迅速插入冰中 3min 以上。 3、 加 4l DIG random labeling Mix（高效） ，混匀后 2000rpm 离心 5min。 4、 置 37反应至少 2h，反应时间越长，产量越高。 5、 加入 2l 0.2M EDTA 或 65 度 10 分钟终止反应。反应液可在-20保存至少 1 年以上，可反复使用。 27 教学方式、手段、媒介：实验讲授、操作示范、指导 板书设计： 讨论、思考题、作业： 完成实验报告 参考书目： 杨安钢，毛积芳，药立波 主编，生物化学与分子生物学实验技术， 高等教育出版社，2001 年版 周先碗，胡晓倩 编， 生物化学仪器分析与实验技术 ，化学工业出版社，2003 年版 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994 年 何忠效，张树政主编，电泳（第二版） ，科学出版社，1999 年 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版） ，高等教育出版社，1997 年 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993 年 教师姓名：李今煜 谢苗 沙莉 职称：讲师 助教 助教 2004 年 月 日 28 福福 建建 农农 林林 大大 学学 教教 案案 编号： 课时安排：12 学时教学课型：理论课 实验课 习题课 实践课 其它 题目（教学章、节或主题）： 实验 Southern 杂交 教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）： 了解 Southern 杂交的原理，学习 Southern 杂交的转膜和杂交技术操作的详细过程。 教学内容（注明：* 重点 # 难点 ？疑点）： 重点：Southern 杂交的原理 难点：转膜的实验操作 实验原理讲解： Southern 杂交是一种在复杂背景基因中识别特异 DNA 序列的重要技术，是 Southern 在 1975 年首 先发明的。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可以按碱基互补配对的原则退 火形成双链。杂交的双方是待测核酸和标记探针。杂交过程是高度特异的。 将电泳分离的 DNA 片段在凝胶上经 NaOH 处理变性，用硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，NC 膜）放在凝胶上，使之按原有的顺序将条带转移到 NC 膜并固定。这就是 Southern 转膜 过程。 Southern 杂交是将膜上的 DNA 与 DIG 标记的探针杂交，通过碱性磷酸酶显色检测结果。 实验步骤