第十三章 细胞的衰老与凋亡

第十三章 细胞的衰老与凋亡 教学目的：1 掌握细胞衰老与凋亡的概念 2 探讨细胞衰老及凋亡的机理 教学重点：影响细胞凋亡的因素 教学难点：细胞凋亡的机理 讲授法 第一节 细胞衰老 概 述 细胞衰老的研究只是整个衰老生物学（老年学，人类学）研究中的一部 分。所谓衰老生物学（biology of senescence）（或称老年学， gerontology）是研究生物衰老的现象、过程和规律。其任务是要揭示生物（人 类）衰老的特征，探索发生衰老的原因和机理，寻找推迟衰老的方法，根本目 的在于延长生物（人类）的寿命。 多细胞有机体细胞，依寿命长短不同可划分为两类，即干细胞和功能细胞。干 细胞在整个一生都保持分裂能力，直到达到最高分裂次数便衰老死亡。如表皮 生发层细胞，生血干细胞等。 一、 早期的细胞衰老研究 100 年前，魏斯曼曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说，后来，Carrel 和 Ebeling 认为细胞本身不会衰老,衰老是由于环境的影响造成的。特别是 20 世纪 40-50 年代，由于 L 系小鼠细胞和 Hela 细胞系的建立，又使细胞不死性的 观点更加巩固。直到 60 年代初，Hayflick 等人的出色工作对细胞不死的观点 彻底动摇了。 二、Hayflick 界限 Hayflick 通过对不同生物的胚成纤维细胞的体外培养，发现物种寿命和培养细 胞寿命之间存在着确切的相互关系。 Hayflick 巧妙的设计实验，进一步证明了决定细胞衰老的因素在细胞内部，而 不是外部环境。 取老年男性个体的细胞（间期无巴氏小体）和年轻女性个体的细胞（间期有巴 氏小体）进行单独或混合培养，并统计其倍增次数。结果发现，混合培养中的 两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养液，当年轻细胞旺 盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了； 年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂； 年老细胞的胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力几乎与年轻 细胞相同。充分说明决定细胞的衰老是细胞核，而不是细胞质。 体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，它们的增殖能力不是无限 的，而是有一定的界限。即 Hayflick 界限。从而引出了细胞最高分裂次数的问 题。 三、细胞在体内条件下的衰老 在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发 生； 正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力也表现出随着有机体年龄的增 高而下降； 衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是 G1 期明显延长； 衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老； 骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢. 四、衰老细胞结构的变化 （一）生活细胞的基本特征 （二）衰老细胞结构的变化 1 细胞核的变化：核膜内折，染色质固缩，核仁不规则。 2 内质网的变化：年轻动物：RER 发育好、排列有序；年老动物：RER 弥散、 总量减少。 3 线粒体的变化：数量随龄减少，体积随龄增大。由于线粒体是细胞呼吸和氧 化的中心，有人称它是决定细胞衰老的生物钟。而有些研究者则认为线粒体不 是衰老的启动者，而是受害者。 4 致密体（脂褐质）的生成：是由溶酶体或线粒体转化而来的。它是自由基诱 发的脂质过氧化作用的产物。 5 膜系统的变化：目前资料表明，膜的改变确实与衰老有密切关系，年轻的功 能健全的细胞膜是典型的液晶相。 6 细胞骨架体系的变化： 7 高尔基体和溶酶体的变化：数量随衰老明显增多。 8 蛋白质合成的变化：合成速率降低。 五、细胞衰老的分子机制（原因及假说） 从古到今，人们对衰老的机理有各种各样的理解，提出了数不清的假说和理论， 据统计，迄今为止曾提出过的衰老假说和理论竟多达 300 种以上！这数百条思 路，除了完全的谬误之外，多是从不同角度和深度反映了衰老这一复杂过程的 某一侧面或层次。直到 90 年代以来，其分子机制的研究才有了重大进展，比如 单基因的突变导致寿命的显著延长、端粒和端粒酶与细胞衰老关系的发现等。 下面介绍 60 年代起开始出现的一系列衰老理论。 （一）氧化性损伤学说（自由基理论） Harman50 年代（1956）提出。认为衰老的一条重要的途径是因自由基脂质的过 氧化而引起细胞功能的多方面异常。 （二）端粒与衰老 发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。端粒由富含 G、C 简单重复顺序所组成， 其长度随细胞衰老过程而逐渐缩短，但端粒酶却可维持端粒的长度。 （三）rDNA 与衰老 酵母染色体外 rDNA 环（ERC）的积累，导致细胞衰老。 （四）沉默信息调节蛋白复合物与衰老 Sir complex 存在于异染色质区，其作 用在于阻断所在位点 DNA 转录。 （五）SGS1 基因、WRN 基因与衰老 SGS1 基因和 WRN 基因同源,编码解旋酶;酵 母 sgs1 突变体寿命明显短于野生型（平均 9.5 代:24.5 代）; wrn 突变引发早 老症。 （六）发育程序与衰老 （七）线粒体 DNA 与衰老 Sen-DNA(80 年代);mtDNA 突变积累与细胞衰老有关。 （八）衰老因子积累说，亦称“蛋白质合成差错成灾说” Megbegeeb（1962）orgel（1973）提出，认为有缺陷的酶干扰复制、转录、 翻译等水平错误积累直至成灾 （九）基因调节Smith 假说 衰老细胞+年轻细胞异质双核细胞（年轻细胞核 DNA 合成受抑制） 衰老细胞+Hela 细胞异核体（衰老细胞被诱导合成 DNA） 说明：1 衰老细胞产生了 DNA 合成抑制剂，穿过胞质，影响正常年轻细胞核 中 DNA 合成。 2Hela 细胞则不受这种抑制剂的影响，相反，它们产生 DNA 合成起始因子， 并诱导衰老细胞核的 DNA 合成。 大脑的衰老中心：近年来：Franks，Finch 等，提出在大脑存在一个“衰老控 制中心”，这就是神经内分泌轴（下丘脑垂体内分泌系统）调控机体各 种生理功能。 六、细胞死亡 细胞死亡是细胞衰老的结果，是细胞生命现象的终止。包括急性死亡（细胞坏 死）和程序化死亡（细胞凋亡）。 细胞死亡最显著的现象，是原生质的凝固。事实上细胞死亡是一个渐进过程， 要决定一个细胞何时已死亡是较因难的。除非用固定液等人为因素瞬间使其死 亡。 那么，怎样鉴定一个细胞是否死亡了呢？通常采用活体染色法来鉴定。如用中 性红染色时，生活细胞只有液泡系染成红色，如果染料扩散，细胞质和细胞核 都染成红色，则标志这个细胞已死亡。 七、关于人类的衰老和寿命问题 人类寿命有无极限？极限是多少？抗衰老，求长寿，古往今来，人之常情，时 至今日，更为人们所关注。研究表明： 1 哺乳动物自然寿命为生长发育期的 57 倍，借此推论，人类完成生长发育 约在 2022 周岁，自然寿命应是 100150 岁。 2 哺乳动物的自然寿命为性成熟的 810 倍。 3 海弗里克（Hayflick）：人体细胞可进行 50 次左右有丝分裂，每次细胞周 期为 24 年，这样推论，人的寿命应在 120 岁左右。 1 遗传与人类寿命：先天性，父辈主宰。父、母享有高寿，其子女往往也是高 寿者。 2 寿命与性别有关：人寿保险公司统计说明，性动物性动物，女人男 人，为什么？众说纷纭。 3 环境与人类寿命：后天因素多样错综复杂。体魄、环境、心理、社会、营养、 疾病等。其中营养及体力活动较为重要。 4 职业与人类寿命： 职业作为一种重要的社会因素，对人类寿命有一定的影响。 日本统计，从事管理工作人员，平均寿命最长，依次为国家机关工作人员、专 业技术人员、商业工作人员、农业工作人员、一般生产工人、体力劳动者、矿 工。 总得说来，近 20 年来，细胞衰老的研究取得了长足的进步，但离开真正揭示细 胞衰老的本质，还要走很长的路。一旦揭开了细胞衰老的秘密，那么延缓衰老， 延长寿命将成为可能，但辩证唯物主义告诉我们，真正的长生不老是不可能的。 我们研究了解细胞衰老死亡规律，目的并不是为了避免死亡，而是要延缓细胞 衰老的到来。 我们讴歌生命，也不必诅咒死亡，有生必有死，无死亦无生，我们不赞成死亡， 但长生不死是进化和发展的敌人。但愿我们每个人都能较长时间生活在这个美 好的世界，为人类的进步与文明做更多的贡献。 第二节 细胞凋亡(Apoptosis) 一、细胞凋亡的概念及其生物学意义 概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常 被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞 吞噬。 这一假说是基于 Hayflick 界限提出的：1961 年 Hayflick 根据人胚胎细胞的传 代培养实验提出。指细胞在发育的一定阶段出现正常的自然死亡，它与细胞的 病理死亡有根本的区别。 生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持 以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。例如：蝌蚪尾的消 失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的 成形过程。 二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征 （一）细胞凋亡与坏死(necrosis) 二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段 或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡 小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡 细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞 坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色 质片段，释放到胞外，导致炎症反应 （二）细胞凋亡的形态学特征 1 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细 胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔 膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核 膜分布。 2 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体 一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起， 逐渐形成单个的凋亡小体。 3 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化 （三）细胞凋亡的生化特征 1 细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp 特征性的 DNA ladders。 2 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶 tTGtissue Transglutaminase）积累并达到较高 水平。 （四）诱导细胞凋亡的因子 1 物理性因子：包括射线（紫外线，? 射线等），较温和的温度刺激（如热激， 冷激）等。 2 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激 素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子?（TNF?），抗 Fas/Apo-1/CD95 抗体等。 （五）细胞凋亡的检测 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 DNA 电泳：DNA 片段就呈现出梯状条带 TUNEL 测定法，即 DNA 断裂的原位末端标记法 彗星电泳法（comet assay） 流式细胞分析：根据凋亡细胞 DNA 断裂和丢失，采用碘化丙啶使 DNA 产生激 发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状 态。 三、细胞凋亡的分子调控机理 （一）Caspase 家族与凋亡 1 Caspase 家族 Caspase 活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是 天冬氨酸残基后的肽键，因此称为 Cysteine aspartic acic specific protease，即 Caspase。 2 Caspase 活化 Caspase 自身以非活化的 Procaspase 存在，其激活依赖于其他 的 Caspase 在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化。 3 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径（凋亡信号通路） 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF 等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚 集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集 Procaspases 聚集在受体部位，Procaspase 相互活化并产生级联反应，使细胞 凋亡。 下游 Caspases 活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体； 裂解 DNase 结合蛋白，使 DNase 释放，降解 DNA 形成 DNA Ladder；裂解参与细 胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导 致膜脂 PS 重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。 （二）Bcl-2、线粒体与细胞凋亡（待修改补充） Bcl-2 是一种原癌基因，是 ced-9 在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡。 Bcl-2 蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域，可与线粒体及内质网膜相结合。 Bcl-2 家族成员的基因中，常常含有三个保守的 Bcl-2 同源区，即 B