细胞生物实验报告

细细 胞胞 生生 物物 学学 实实 验验 论论 文文 年级：年级：2012 级师范级师范 2 班班 姓名：田金梅姓名：田金梅 学号：学号：222012317011114 指导老师：魏玲指导老师：魏玲 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 （西南大学生命科学学院 重庆 400715） 摘要：摘要：细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，掌握细胞培养技术有利 于我们掌握一种非常重要的实验技术方法。本次实验通过用人体外周血淋巴细胞为材料， 进行 PHA 处理然后再 37下培养 72 小时，并在离培养终止 34 小时添加秋水仙素处理， 然后经过低渗离心固定的反复操作，将细胞收集以及处理成合适的装片，然后通过冰片滴 片的方式，再由 Gemesa 染液染色，再镜检，找到含 46 条染色体合适的细胞，再用显微拍 照技术拍照，得到的图片经过简单处理，剪切，并测量数据，最后得到核型分析图谱。 关键词：关键词：细胞培养；PHA；人体外周血淋巴细胞；染色体装片制备; 核型分析 综述：细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，也是当前细 胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验, 它为细胞学、遗 传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。细胞培养是指从体内组 织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下， 使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单 个细胞或细胞群。近年来发展起来的核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移 以及一些物理图谱的建立，也都需要与细胞培养紧密结合【12】。 人的 1ml 外周血约含有 110*6310*6 个小淋巴细胞，它们几乎都处于 G0 或 G1 期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经 PHA（植 物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素， 使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗 盐溶液（一般是 0.075mol/L 的 KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和 一部分细胞质除去然后用 Carnoy 固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好 的染色体标本。 核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序 排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正 常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idiogram)是 以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的， 是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞 的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致， 称为核型分析（karyotype analysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨 动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。 1.1.材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.11.1.1 材料：材料：人的静脉外周血（男女各 2ml，在校医院添加肝素钠抽取血样） 1.1.21.1.2 实验工具：实验工具：恒温培养箱（1）、电冰箱（1）、高压灭菌锅（1）、离心机 （1）、普通光学显微镜（7）、显微摄影的照相机（1）、培养瓶（4）、离心 管(4)、移液枪(2)、胶头(4)、滴管(4)、烧杯(4)、试管架、插管(5)、试剂瓶 (4),载玻片（10）。 1.1.31.1.3 试剂：试剂：肝素、完全 RPMI1640 培养粉、秋水仙素、0.075mol/lKCl、植 物血球凝集素（PHA）、青霉素、链霉素、小牛血清、秋水仙素、无水酒精、冰 醋酸、Giemsa 粉末、甘油、甲醇、1/15 mol/L 的 PH 为 6.8 的磷酸缓冲液。 1.21.2 方法方法 1.2.11.2.1 人体外周血淋巴细胞的培养人体外周血淋巴细胞的培养 接种和培养接种和培养：在无菌工作台上，打开培养瓶的瓶塞，加入 3ml 培养基， 然后再加入母液为 5mg/mL PHA 男 1 女 1 各加 45ul 使其终浓度为 75ug/ml，男 2 女 2 各加 50ul 使其终末浓度处于 83ug/ml,再向每瓶加入 0.3mL 血液，轻轻摇 匀 ，置 37 培养箱中培养 72h 。 培养细胞的秋水仙碱处理培养细胞的秋水仙碱处理：培养终止前 3h4h 将新鲜配制的 50gmL 秋水仙素工作液注入培养瓶中，每瓶 40ul 使其终浓度为 0.6ug/ml，轻轻摇匀， 放回培养箱中，继续培养至 72h。 1.2.21.2.2 制片及染色体标本制备制片及染色体标本制备 低渗及离心低渗及离心：小心从培养箱取出培养瓶，用吸管将培养后的血细胞混匀， 并移至离心管内，以 1000rmin 离心 10min，吸弃上清液，加入 8mL37 预热 的 0.075mmolL 氯化钾低渗液，用吸管上下吹打约 10 次，使细胞悬浮于低渗 液中，置 37 水浴箱中，温育 20min，使低渗充分。 固定固定：低渗终止后，加入新鲜配制的卡诺固定液（甲醇：冰醋酸3:1） 1mL，预固定 2min ，打匀，放入离心机内，以 1000 rmin 离心 8 分钟 min， 倒掉上清液，继续加入固定液 5mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬 液。室温下静置 20min，以 1000rmin 离心 8min，倒掉上清液。 重复固定重复固定：再加入固定液mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合 细胞悬液，室温下静置 20min ，以 1000rmin 离心 8min，倒掉上清液 。 制片制片：向离心管中加入固定液 0.5mL，用吸管轻轻吹打成混合细胞悬液。 滴片时，先用吸管吸取少量细胞悬液以 1.8m 高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻 片上，每片 23 滴，随即对准玻片吹一口气，以协助细胞的分散，然后在乙醇 灯火焰上方过火 5 秒，最后在烘箱中烘干。 染色染色：将晾干的玻片标本用 Giemsa 染液染色 20min（用 1 份 Giemsa 原 液加 9 份 pH6.8 的磷酸缓冲液），自来水缓缓冲洗玻片，并烘干，镜检。 结果观察结果观察：取制备好的健康人体染色体标本，先用低倍镜观察，选择染 色体分散良好、无重叠的分裂中期细胞，转换油镜下仔细观察分析。 1.2.31.2.3 染色体组型分析染色体组型分析 找好的染色体找好的染色体：在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色 单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄并确定数目：n 拍照分剪：拍照分剪：将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条 一条剪下。 测量与计算测量与计算: : 将照片上的染色体进行编号, 用直尺测量每一染色体的 长度, 此长度为其绝对长度。计算每一染色体的相对长度, 即每条染色体的 长度除以全部染色体的总长度。测量染色体短臂和长臂的长度, 并求出其臂 比, 即长臂长/ 短臂长。将测量的数据记入表相应栏内 配对配对: : 根据染色体的相对长度、臂比、次缢痕的有无和位置、形状大小, 随体有无, 着丝点位置, 将其相同表型的染色体从照片上剪下来, 将其同源染 色体配成对。 排列：排列：染色体的排列通常是从大到小, 按长度顺序编号, 等长的染色体, 把短臂长的放在前面, 具有特殊标记的如具随体的染色体, 一般排在最后, 性 染色体要单独列出。 分类分类: : 以臂比数值确定着丝点位置, 据此可将染色体分成五种类型, 即 正中部着丝点染色体(M ) 臂比( 长/ 短) 1.0。 中部着丝点染色体( m ) 臂比( 长/短) 1.0-1.7 近中着丝点染色体 s( m )臂比( 长/ 短) 1.7-3.0 近端着丝点染色体( st ) 臂长( 长/短) 3.0-7.0 端部着丝点染色体(t )臂比( 长/短) 7.0 以上 将所得的各项数据填入下列表中 组号染色体号相对长度形态 大小 长臂短臂臂比类型 粘贴拍照：粘贴拍照：将配对排列好的染色体组型, 贴在白卡片纸上, 进行拍照, 制成染色体组型图。 注：对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下 3 个： 相对长度相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X 或 Y 染色体)的总长 度100% 臂指数臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数） 着丝粒指数着丝粒指数=短臂/整个染色体长度100%（反映着丝粒位置的指数） 人类体细胞的正常核型是含有 23 对染色体，共 46 条。其中 22 对是男女共 有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男 XY，女 XX。 人类染色体组型 群组号染色体号形态大小着丝粒位置随体次缢痕鉴别程度 A13 最大 m 无常见 1 号可鉴定 B45 次大 sm 无不易 C612+X 中等 sm 无常见 9 号难鉴定 D1315 中等 st 有偶见 13 号难鉴定 E1618 较小 16m,17m, 和 18m 无常见 16 号可鉴定 F1920 小 m 无不易 G2122+Y 最小 st 有，Y 无难鉴定 2.2.结果分析结果分析 用第二组的女生图片做的核型分析 13 4-5 A B 6-12 X C 16-18 E 13-15 D 19-20 F 21-22 G 我们组在油镜下用相机拍的男生图片和用它做的核型分析 女生染色体核型分析数据 群组号群组号染色体号染色体号相对长度相对长度形态大小形态大小臂指数臂指数着丝粒指数着丝粒指数着丝粒位置着丝粒位置 A17.84%最大最大1.1247.10%M A26.65%最大最大0.8842.20%M A35.60%最大最大1.2444.70%M B45.90%次大次大2.3330.00%Sm B54.55%次大次大1.5838.70%M C65.60%中等中等1.2444.70%M C74.70%中等中等1.4840.60%M C84.85%中等中等2.330.30%Sm C94.25%中等中等1.934.50%Sm C104.10%中等中等1.1646.40%M C114.40%中等中等1.540.00%M C123.80%中等中等1.9234.10%Sm CX5.60%中等中等1.5738.90%M D134.40%中等中等1.540.20%M D143.60%中等中等2.529.10%Sm D153.40%中等中等7.512.80%St E163.70%中等中等t E173.05%中等中等1.3542.70%M E183.25%中等中等1.4540.80%M F192.90%小小1.540.00%M F202.65%小小t G212.40%最小最小1.3343.70%M G222.10%最小最小t 男生染色体核型分析数据 群组号群组号染色体号染色体号相对长度相对长度形态大小形态大小臂指数臂指数着丝粒指数着丝粒指数着丝粒位置着丝粒位置 A14.20%最大最大1.270.442M A23.80%最大最大1.290.436M A33.00%最大最大1.140.167M B43.30%次大次大1.420.412M B53.30%次大次大2.40.294Sm C62.40%中等中等20.033Sm C72.40%中等中等1.40.417M CX2.10%中等中等1.120.455M C82.10%中等中等1.750.364Sm C92.40%中等中等20.333Sm C102.40%中等中等20.333Sm C112.10%中等中等2.670.273Sm C122.40%中等中等1.40.417M D131.70%中等中等3.50.222St D142.40%中等中等40.2St D151.70%中等中等3.50.222St E161.60%中等中等1.660.375M E171.60%中等中等1.660.375M E181.40%中等中等1.330.429M F191.20%小小20.333Sm F201.40%小小2.50.286Sm G211.10%最小最小30.266Sm G221.00%最小最小1.50.4m GY0.80%最小最小30.25Sm 结果分析：人体正常细胞核型含 46 条染色体，相互配对成 23 对。其中 22 对为 男女共有的常染色体。另一对男生为 XY，女生为 XX 是男女所独有的决定性别 的性染色体。第一次我们班集体失败的原因可能是在医院采学的时候加的是 EDTA 而不是肝素使得 PHA 的作用没能表现出来，也可能是第一次老师给的 PHA 效价本来就不高。 而第二次实验时，细胞培养过程中每个培养瓶中均出现血细胞凝集现象，定期 的摇动可以将其分散。但制片后效果不是很好，我们组男生装片的细胞数量比 较少，这可能是我们组有一个同学在收集细胞第一次离心后倒上清液时把底层 细胞也给倒掉了。而我们女生组有一张装片是制得很好，细胞和分裂相也比较 多的，但最后片子找不到了，所以以后有什么实验大家一定要注意保管好自己 的材料。而另外两三张不好的片子中有的没有细胞只有一些蓝色斑块，可能是 大家在滴液的时候没有滴到了较边缘位置，然后同学吹的时候又没注意力度和 方向使得上面存在的细胞不多然后洗的时候片子又没洗干净。 而对于最后的对于染色体的分布配对的数据可以看出，有的我们分析得到的数 据跟理论值是有偏差的，这主要是因为在配对时由于染色体并不都以比较直的 形态正对我们，而出现我们测量时的长度不够准确，还有就是染色体不够清晰， 其着丝粒不是太容易找准确包括染色体的长度测量也都比较模糊，本次实验的 随体等更是不容易观察，而本来有的染色体就不易区分，这就造成了我们结果 的不准确性。 3.3.讨论讨论 人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞，它的细胞质很少，RNA 和蛋白质 的合成速度也很慢，以致很难进行分裂，通常情况下它们都处于间期的 Gl 期 Go 或期，故在未经培养的外周血中很难见到正在分裂的淋巴细胞，但是在 PHA 的刺激下处于 Go 期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，重新进入细胞周期进行有 丝分裂。培养基中 PHA 使用量的过多或过少，将直接影响实验中收获的有丝分 裂期的细胞量。在使用前应进行进行定量测试，仅凭经验按常规量加入 PHA， 将导致实验结果不一致，分裂相多少相差很大，直接影响实验课效果【3】。 导致细胞培养失败的原因很多，但在培养条件相对恒定的环境中主要因素 是抗生素类药物的干扰其可能对淋巴细胞的转化产生抑制作用。培养中出现凝 血和溶血与培养液的 PH 值 PHA 和血中的肝素等的抗凝剂有关，凝血和溶血对细 胞培养有一定影响但也有培养成功的所以不要放弃培养。抗凝血剂的选择也很 重要，应选能被直接用于人体静脉注射的最好，比如肝素或者肝素钠，而 EDTA 为金属离子螯合剂对淋巴细胞有一定毒性对温度对细胞培养也是很重要的。秋 水仙素是纺锤体的抑制剂，如果秋水仙素的使用浓度过高或使用时间过长，虽 然得到的细胞分裂相很多但是染色体过于的浓缩，若溶度过低或者处理时间过 少则分裂相少。离心时收集细胞般离心速度是 1000rmin 低渗后细胞膨胀若离 心速度过大会提前破裂，染色体丢失严重影响细胞计数和染色体核型分析【4】。 用于显微分离的染色体标本制备方法与常规制片基本相同, 只是固定液中酸 的比率要适当降低, 以减少酸对 DNA 的破坏, 宋文芹在制片中用 70%酒精取代 了传统的固定液。为使细胞质背景清楚, 崔丽华等采用去壁低渗法, 提高了染 色体分离的效率。但无论用什么方法, 都要使染色体尽量散开, 易于识别目标 染色体【6】。 核型是根据细胞分裂中期浓缩的染色体形态结构建立的, 核型模式图通常是 将显微拍摄的染色体照片剪贴、整理、绘制而成。不同的物种具有不同的核型, 因此核型是区别物种的基本遗传学依据,也对分子生物学的研究具有指导意义。 对于核型分析现在并不停留在染色体形态分析时期，随着科学技术的发展出现 了显带技术。显带技术主要包括荧光显带技术和 Gimesa 显带技术。1968 年 T.Q.Casperson 发明了 Q-带技术。1971 年，Arrighi 发明了 Gimesa 显带技术。 在对染色体测量和分析上也有一些新技术出现，如有的学者开始使用 Photoshop 等软件对染色体图片进行处理