紫外-可见分光光度法 中国药品检验标准操作规范 2010年版

紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 1 简述简述 紫外-可见分光光度法是通过被测物质在紫外光区或可见光区的 特定波长处或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性和定量 分析的方法。本法在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量 测定。 定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用 对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定； 对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该 物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸 收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。 物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产 生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称 电子光谱。有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色 基团，均可在紫外区（200400nm）或可见光区（400850nm）产 生吸收。通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为 190900nm。 紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯-比尔 （Lambert-Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分 析的依据，其数学表达式为： = 1 = 式中 A 为吸光度； T 为透光率； E 为吸收系数； c 为溶液浓度； l 为光路长度。 如溶液的浓度（c）为 1%（g/ml） ，光路长度（l）为 1cm，相应 的吸光度即为吸收系数，以 E表示。如溶液的浓度（c）为摩尔 1% 1cm 浓度（mol/L） ，光路长度为 1cm 时，则相应的吸收系数为摩尔吸收 系数，以 表示。 2 2 仪器仪器 紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、 记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。 为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有两种光源， 即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。 单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件， 聚焦透镜或反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅两种，棱镜多用 于天然石英或熔融硅石制成，对 200400nm 波长光的色散能力很强， 对 600nm 以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀 排光谱。光栅系将反射或投射光经衍射而达到色散的作用，故常称 为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光 束仪器多用光栅为色散元件。 检测器有光电管和光电倍增管两种。 紫外-可见分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同可分为 单光束和双光束分光光度计两种。单光束分光光度计有些仍为手工 操作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光 率或吸光度，操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但 适用于单波长的含量测定。双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光 路使分成样品（S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测 器信号经调制分离成两光路对应新号，新号的比值可直接用记录仪 记录，双光束分光光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但 作含量测定时，为求准确起见，仍宜用固定波长的测量方式。 3 3 紫外紫外- -可见分光光度计的检定可见分光光度计的检定 3.1 波长准确度 3.1.1 波长准确度的允差范围 紫外-可见分光光度计波长准确度允 许误差，紫外区为1nm，500nm 处2nm。 3.1.2 波长准确度检定方法 3.1.2.1 用低压汞灯检定 关闭仪器光源，将汞灯（用笔式汞灯最方 便）直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式， 采用波长扫描方式，扫描速度“慢” （如 15nm/min） 、响应“快” 、 最小狭缝宽度（如 0.1nm） 、量程 0100%，在 200800nm 范围内单 方向重复扫描 3 次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测” 功能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描） 。 用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长： 237.83、253.65、275.28、296.73、302.15、313.16、334.15、365.0 2、365.48、366.33、404.66（紫色） 、435.83（蓝色） 、546.07（绿 色） 、576.96（黄色）及 579.07nm。 3.1.2.2 用仪器固有的氘灯检定 本法主要用于日常工作中波长准确 度的核对。取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方 法，对 486.02nm 及 656.10nm 二单峰进行方向重复扫描 3 次。 3.1.2.3 用氧化钬玻璃检定 将氧化钬玻璃放入样品光路，参比光路 为空气，按测定吸收光谱图方法测定。校正自动记录仪器时，应考 虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。 氧化钬玻璃在 279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536.2 及 637.5nm 波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定用。氧化钬玻璃因 制造的原因，每片氧化钬的吸收峰波长有差异，另外，在放置过程 中也会发生波长漂移，因此需定期由计量部门校验。 3.1.2.4 用高氯酸钬溶液检定 本法可供没有单光束测定功能的双光 束紫外分光光度计波长准确度检定用。 高氯酸钬溶液的配制方法：取 10%高氯酸为溶剂，加入氧化钬 （Ho2O3）配成 4%溶液即得。 高氯酸钬溶液较强的吸收峰波长为 241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.3 0、485.29、536.64、640.52nm。 如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的（指是直接将信 号描记于记录纸上） ，记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长， 为了准确测定，建议采用定点检定而不是扫描方式。 3.2 吸光度准确度 精密称取在 120干燥至恒重的基准重铬酸钾 约 60mg，置 1000ml 量瓶中，用 0.005mol/L 硫酸液溶解并稀释至 1000ml，用配对的 1cm 石英池，以 0.005mol/L 硫酸液为空白，在 235、257、313、350nm 分别测定吸光度，然后换算成 E，测得值应 1% 1cm 符合表 1 中规定的允差范围。 表表 1 1 分光光度法允差范围分光光度法允差范围 波长吸收强度 吸收系数 E 1% 1cm 允差范围 235 最小 124.5 123.0126.0 257 最大 144.0 142.8146.2 313 最小 48.6 47.050.3 350 最大 106.6 105.5108.5 分辨率、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按现行国家 技术监督局“双光束紫外-可见分光光度计检定规程”检定，应符合 有关项下的规定。日常使用中，对以上两项，即波长和吸光度准确 度应根据需要随时检查。 3.3 杂散光的检查 可按表 2 所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置 1cm 石英池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表 2 中规定。 表表 2 2 杂散光的检查及限度杂散光的检查及限度 试剂浓度（%，g/ml）测定用波长 （nm） 透光率（%） 碘化钠 1.002200.8 亚硝酸钠 5.003400.8 4 4 样品测定操作方法样品测定操作方法 4.1 吸收系数测定（性状项下）按各品种项下规定的方法配制供试 品溶液，在规定的波长处（参见 5.8 项）测定其吸光度，并计算吸 收系数，应符合规定范围。 4.2 鉴别及检查 按各品种项下的规定，测定供试品溶液的最大及最 小吸收波长，有的并须测定其在最大吸收波长与最小吸收波长处的 吸光度比值，均应符合规定。 4.3 含量测定 4.3.1 对照品比较法 按各品种项下规定的方法，分别配制供试品溶 液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液 中被测成分标量的 100%10%以内，用同一溶剂，在规定的波长处 测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。 4.3.2 吸收系数法 按各品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及 该波长2nm 处测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸 收系数计算含量。 4.3.3 计算分光光度法 按中国药典规定，计算分光光度法一般 不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，应严格 按各品种项下规定的方法进行。用本法时应注意：有一些吸光度是 在待测成分吸收曲线的上升或下降陡坡处测定，影响精度的因素较 多，故应仔细操作，尽量使供试品和对照品的测定条件一致。若该 品种不用对照品，如维生素 A 测定法（见中国药典附录） ，则应 在测定前对仪器作仔细的校正和检定。 4.3.4 比色法 供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外 光区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂， 使反应产物的最大吸收移至可见光区。 用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取 供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的 空白系指同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等 量的相应试剂，并用同样方法处理。 当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量对照品 溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然 后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在 标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。 5 5 注意事项注意事项 5.1 试验中所用的量瓶和移液管均应经检定校正、洗净后使用。 5.2 使用的石英吸收池必须洁净。当吸收池中装入同一溶剂，在规 定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在 0.3%以下者可配对 使用，否则必须加以校正。 5.3 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装样品溶液的体积以池 体积的 4/5 为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由 上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂，为防止溶剂挥发后溶质残留 在池子的透光面，可先用蘸有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干 擦镜纸拭净。吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。使用 后用溶剂及水冲洗干净，晾干，防尘保存，吸收池如污染不易洗净 时可用硫酸发烟硝酸（3：1V/V）混合液稍加浸泡后，洗净备用。如 用铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则 清洁液中的铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲 洗，以防铬酸钾吸附于吸收池表面。 5.4 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此， 当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如 甲醇、乙醇的截止使用波长为 205nm。另外，当溶剂不纯时，也可 能增加干扰吸收。因此，在检查所用的溶剂在供试品所用的波长附 近是否符合要求，即将溶剂置 1cm 石英吸收池中，以空气为空白 （即空白光路中不置任何物质）测定其吸收光度，溶剂和吸收池的 吸光度应符合表 3 规定。 表表 3 3 以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定 波长范围（nm） 220240 241250 251300 300 以上 吸光度 0.40 0.20 0.10 0.05 每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的同批溶剂。 5.5 称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可 能少，转移稀释时取容积一般不少于 5ml。含量测定时供试品应称 取 2 份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取 2 份。吸收系数 检查也应称取供试品 2 份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应 在0.5%以内。作鉴别或检查可取样品 1 份。 5.6 供试品溶液的浓度，除各品种项下已有注明者外，供试品溶液 的吸光度以在 0.30.7 之间为宜，吸光度读书在此范围误差较小， 并应结合所用仪器吸光度线性范围，配制合适的读数浓度。 5.7 选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸收带半高宽的 10%， 否则测得的吸光度值会偏低，或以减小狭缝宽度时供试品溶液的吸 光度不再增加为准，对于中国药典紫外分光光度法测定的大部 分品种，可以使用 2nm 缝宽，但当吸收带的半高宽小于 20nm 时，则 应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾及钠的吸光度检查需用 1nm 缝宽 或更窄，否则其 264nm 的吸光度会偏低。 5.8 测定时除另有规定者外，应在规定的吸收峰2nm 处，再测几 点的吸光度，以核对供试品的吸收峰位置是否正确，并以吸光度最 大的波长作为测定波长，除另有规定外吸光度最大波长应在该品种 项下规定的波长加减 2nm 以内，否则应考虑试样的同一性、纯度以 及仪器波长的准确度。 5.9 用于制剂含量测定时，应注意供试液与对照液的 PH 值是否一致， 如 PH 值对吸收有影响，则应调溶液的 PH 值一致后再测定吸光度。 6 6 结果计算结果计算 6.1 对照品比较法 可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照 品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。 C样品=A样品C对照/A对照 式中 A 为吸光度值； C 为测试液浓度（以 mg/ml 计） 6.2 吸收系数法中国药典规定的吸收系数，系指E，即在指定 1% 1cm 波长时，光路长度为 1cm，试样浓度换算为 1%(g/ml)时的吸光度值， 故应先求被测样品的 E值，再与规定的 E值比较，可计算出 1% 1cm 1% 1cm 供试样品的含量。 E 样品= 1% 1cm 式中 A 为供试品溶液测得的吸光度值； c 为供试品溶液的百分浓度，即 100ml 中所含溶质的克数 （g/ml） ； l 为吸收池的光路长度（cm） 供试品的含量%= 1% 1(样品) 1% 1(标准) 100 式中 为根据前式计算出的供试品吸收系数； 1% 1(样品) 为药典或药品标准中规定的吸收系数。 1% 1(标准) 7 7 吸收系数测定法吸收系数测定法 本法主要用于新品种的吸收系数测定。 7.1 测定方法 取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度 读数在 0.60.8 之