紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞toll样受体3和4的信号转导途径

中国组织工程研究 第17卷 第53期 20131231 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.014 付元，刘秀琴，程娜，张守青，常红，张秋业，陈秀霞，高兴娟. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径J. 中国组织工程研究，2013，17(53):9182-9188. P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9182 www.CRTER.org 付元，女，1987 年生， 山东省曲阜市人，青岛大 学医学院在读硕士，主要 从事肾脏疾病与免疫疾病 的研究。 fy_ 通讯作者：常红，副主任医 师，硕士生导师，青岛大 学医学院附属医院儿内科， 山东省青岛市 266003 changhong1970 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)53-09182-07 修回日期：2013-10-17 (201308011/WW) Fu Yuan, Studying for masters degree, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China fy_ Corresponding author: Chang Hong, Associate chief physician, Masters supervisor, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China Accepted: 2013-10-17 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径* 付 元1，刘秀琴2，程 娜1，张守青1，常 红1，张秋业1，陈秀霞1，高兴娟3 (1青岛大学医学院附属医院儿内科，山东省青岛市 266003；2青岛市市立医院儿内科，山东省青岛市 266003；3烟台市毓璜顶医院儿内科，山东省烟台市 264000) 文章亮点： 1 文章的特点在于应用荧光定量 PCR 和流式细胞技术检查了 TLR3 和 TLR4 在外周血单个核细胞的表 达量及相关性，分析了过敏性紫癜患儿有肾脏损伤和无肾脏损伤的免疫紊乱情况。 2 结果提示 Toll 样受体 4 活化可能是导致过敏性紫癜免疫功能紊乱的始动因素之一，Toll 样受体 4 的过 度活化与过敏性紫癜的肾脏损伤有关。 关键词： 器官移植；器官移植基础实验；过敏性紫癜；紫癜性肾炎；单个核细胞；Toll 样受体 3；Toll 样受体 4；髓 样细胞分化因子 88；髓样分化蛋白 2；白细胞介素类；省级基金 主题词： 紫癜，过敏性；Toll 样受体 3；Toll 样受体 4；白细胞介素类 基金资助： 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2011SW006)* 摘要 背景：目前关于 Toll 样受体 3 和 Toll 样受体 4 介导的信号转导通路在紫癜性肾炎的发病机制中的作用尚不 清楚。 目的：分析 Toll 样受体 3 和 Toll 样受体 4 在过敏性紫癜和紫癜性肾炎发病机制中的作用。 方法：选取过敏性紫癜患儿 64 例，分为过敏性紫癜无肾损害组 36 例及过敏性紫癜性肾炎组 28 例，另选健 康儿童 30 例作为正常对照组。实时荧光定量 PCR 检测外周血单核细胞 Toll 样受体 3、Toll 样受体 4、髓样 分化蛋白 2、髓样细胞分化因子 88、白细胞介素 1、白细胞介素 6、白细胞介素 12 mRNA 的基因相对表达 量；应用流式细胞术检测外周血单核细胞 Toll 样受体 3、Toll 样受体 4 蛋白表达率。 结果与结论：过敏性紫癜患儿 Toll 样受体 4 mRNA 及蛋白表达显著高于正常对照组(P 0.05)；Toll样受体4 mRNA、Toll样受体4蛋白表达均显著高于正常对照组 (P 0.05 0.05 0.05 0.05 表 4 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核 细胞 Toll 样受体 4 mRNA 和蛋白的表达变化 Table 4 Expression of Toll-like receptor 4 mRNA and protein in peripheral blood mononuclear cells of non-Henoch- Schnlein purpura nephritis patients, Henoch- Schnlein purpura nephritis patients and healthy controls (Error!s) 与紫癜无肾损害组比较，aP 0.05；与正常对照组比较，bP 0.05。 注：紫癜性肾炎组 Toll 样受体 4 mRNA、Toll 样受体 4 蛋白表达均显著高 于紫癜无肾损害组。 组别Toll 样受体 4 mRNAToll 样受体 4 蛋白 紫癜性肾炎组 紫癜无肾损害组 正常对照组 F 1.940.65ab 1.470.75 1.040.49 14.05 0.410.22ab 0.290.12 0.140.75 23.58 图 2 正常对照组外周血单个核细胞 Toll 样受体 4 蛋白表达 Figure 2 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the control group 注：过敏性紫癜患儿 Toll 样受体 4 蛋白表达显著高于正常对 照组(P 0.05)。 图 3 紫癜无肾损害组外周血单个核细胞 Toll 样受体 4 蛋白 表达 Figure 3 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the non- Henoch-Schnlein purpura nephritis group 注：紫癜无肾损害组 Toll 样受体 4 蛋白表达显著低于紫癜性 肾炎组。 付元，等. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9186 www.CRTER.org 紫癜性肾炎组髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子 88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达显著 高于紫癜无肾损害组，差异均有显著性意义(P 0.05)， 紫癜性肾炎组白细胞介素12 mRNA的表达显著低于紫 癜无肾损害组，差异有显著性意义(P 0.05)，见表 6。 2.5 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与Toll样受体4蛋白表达相关性 过敏性紫癜组 患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA与Toll样受体4 蛋白表达呈正相关(r=0.60，P 0.01)，见图5。 2.6 过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA 与其他相关分子表达相关性 过敏性紫癜患儿Toll样受体 4mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化因子88、白细胞 介素1、白细胞介素6表达均呈正相关(P 0.05)，与白细 胞介素12 mRNA表达呈负相关(r=-0.66，P 0.01)，见表 7。 图 4 紫癜性肾炎组外周血单个核细胞 Toll 样受体 4 蛋白表 达 Figure 4 Protein expression of Toll-like receptor 4 in the Henoch-Schnlein purpura nephritis group 注：紫癜性肾炎组 Toll 样受体 4 蛋白表达显著高于紫癜无肾 损害组。 表 5 过敏性紫癜组与正常对照组外周血单核细胞髓样分化蛋 白 2、髓样细胞分化因子 88、白细胞介素 1、白细胞 介素 6、白细胞介素 12 mRNA 的表达 Table 5 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-12 in the Henoch-Schnlein purpura and control groups (Error!s) 注：过敏性紫癜组髓样分化蛋白 2、髓样细胞分化因子 88、白细胞介素 1、白细胞介素 6 mRNA 的表达显著高于正常对照组，白细胞介素 12 mRNA 的表达显著低于正常对照组。 指标过敏性紫癜组正常对照组tP 髓样分化蛋白 2 髓样细胞分化因子 88 白细胞介素 1 白细胞介素 6 白细胞介素 12 1.150.37 1.210.39 1.520.45 1.050.32 0.430.17 0.830.30 0.870.22 0.790.38 0.680.33 0.690.20 4.09 5.39 6.29 4.21 5.31 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 表 6 紫癜性肾炎、紫癜无肾损害组和正常对照组外周血单核 细胞髓样细胞分化因子 88、髓样分化蛋白 2、白细胞介 素 1、白细胞介素 6、白细胞介素 12 mRNA 的表达 Table 6 mRNA expressions of myeloid differentiation protein 2, myeloid differentiation factor 88, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-12 in the non-Henoch-Schnlein purpura nephritis, Henoch-Schnlein purpura nephritis and control groups (Error!s) 与紫癜无肾损害组比较，aP 0.05；与正常对照组比较，bP 0.05。 注：紫癜性肾炎组髓样分化蛋白 2、髓样细胞分化因子 88、白细胞介素 1、白细胞介素 6 mRNA 的表达显著高于紫癜无肾损害组，紫癜性肾炎 组白细胞介素 12 mRNA 的表达显著低于紫癜无肾损害组。 指标过敏性紫癜组 紫癜无肾损害组正常组tP 髓样分化蛋白 2 髓样细胞分化 因子 88 白细胞介素 1 白细胞介素 6 白细胞介素 12 1.260.37ab 1.350.45ab 1.640.30ab 1.130.27ab 0.330.12ab 1.060.36 1.100.30 1.320.54 0.920.36 0.590.12 0.830.30 0.870.22 0.790.38 0.680.33 0.690.20 11.41 15.25 29.23 14.34 66.08 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 图 5 过敏性紫癜组外周血单核细胞 Toll 样受体 4 蛋白与 Toll 样受体 4 mRNA 的相关图 Figure 5 Correlation between Toll-like receptor 4 protein and mRNA expression in the Henoch-Schnlein purpura group 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Toll 样受体蛋白 0 1 2 3 4 Toll 样受体 4 mRNA 注：过敏性紫癜组患儿外周血单核细胞 Toll 样受体 4 mRNA 与 Toll 样受体 4 蛋白表达呈正相关(r=0.60，P 0.01)。 表 7 过敏性紫癜组 Toll 样受体 4 与各因子的表达相关性 Table 7 Correlation expression of Toll-like receptor 4 and other receptors in the Henoch-Schnlein purpura group 注：过敏性紫癜患儿 Toll 样受体 4 mRNA 与髓样分化蛋白 2、髓样细胞分 化因子 88、白细胞介素 1、白细胞介素 6 表达均呈正相关，与白细胞介 素 12 mRNA 表达呈负相关。 指标 r P 髓样分化蛋白 2 髓样细胞分化因子 88 白细胞介素 1 白细胞介素 6 白细胞介素 12 0.66 0.67 0.66 0.64 -0.66 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 付元，等. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9187 www.CRTER.org 3 讨论 Discussion 过敏性紫癜是儿童时期较常见的一种小血管炎， 发病率高，容易反复，根据不同的临床症状及体征， 可将过敏性紫癜分为皮肤型、腹型、肾型、关节型、 混合型等，据文献报道20%-80%的过敏性紫癜患儿会 有肾损害发生9-10。其病因及发病机制尚未完全明确， 可能涉及体液免疫和细胞免疫紊乱，同时有细胞因子 和炎症介质的参与。 Toll样受体是天然免疫模式识别受体之一，与微生 物的病原相关分子模式识别激活固有免疫系统；研究 发现Toll样受体分布十分广泛，不同的TLR在不同组织 及细胞表达有所不同，主要表达于单核-巨噬细胞、树 突状细胞等11。 TLRs识别配体包括外源性及内源性两种，Toll样 受体3主要识别病毒感染细胞后产生的dsRNA12，Toll 样受体4主要识别脂多糖，髓样分化蛋白2蛋白与Toll样 受体4胞外区结合而定位于细胞表面13，并促进细胞对 脂多糖的反应。TLR信号通路包括髓样细胞分化蛋白 88依赖性或髓样细胞分化因子88非依赖性途径激活核 转录因子B、IRF3诱导细胞因子及趋化因子基因转录。 Toll样受体3主要参与非髓样细胞分化因子88依赖的转 导14，Toll样受体4既参与髓样细胞分化因子88依赖的 转导又参与非髓样细胞分化因子88依赖转导途径15。 目前研究较为明确的为髓样细胞分化因子88依赖途径。 TLR通过两条信号途径转导细胞信号后，一方面刺激 天然免疫细胞分泌大量的细胞因子、趋化因子诱导炎 症反应，另一方面诱导树突状细胞活化及成熟，促进 协同刺激分子和趋化因子的表达与释放，从而诱导T细 胞活化、增殖和发育。因此TLRs是连接天然免疫和获 得性免疫的桥梁16。 近年来国内外研究显示，TLRs信号通路在自身免 疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排 斥反应中发挥重要的作用。研究发现TLRs在肾小管上 皮细胞、足细胞、肾小球系膜细胞等肾脏固有细胞及 间质树突状细胞中表达17，TLRs信号通路介导多种感 染性和非感染性肾脏疾病，如尿路感染、脓毒症引起 肾衰竭、肾脏再灌注损伤、病毒性相关性肾炎、IgA肾 病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小 病变性肾病、肾纤维化等18-23。但TLRs与过敏性紫癜、 紫癜性肾炎的相关报道较少。 本组结果显示，过敏性紫癜患儿Toll样受体3 mRNA及蛋白表达与正常对照组比较，差异无显著性； 过敏性紫癜患儿Toll样受体4mRNA及蛋白的表达均高 于正常对照组，过敏性紫癜有肾脏损害组Toll样受体 4mRNA及蛋白的表达量均高于过敏性紫癜无肾脏损害 组；提示Toll样受体4活化可能是导致过敏性紫癜免疫 功能紊乱的始动因素之一，Toll样受体4的过度活化与 过敏性紫癜的肾脏损伤有关。 白细胞介素1主要是由单核细胞和树突状细胞合 成，当作用于肾小球系膜细胞后还可刺激系膜细胞合 成白细胞介素1。该细胞因子可刺激肾小球系膜细胞 合成降解胶原和基底膜的中性蛋白酶从而破坏肾小球 24；还可刺激系膜细胞分泌单核细胞趋化因子，趋化 单核巨噬细胞的浸润，促进局部肾脏炎症反应。同时 白细胞介素1可促进内皮细胞合成纤溶酶原激活物抑 制剂1(PAI-1)，使纤溶酶原活性下降，促进凝血，促使 新月体的形成，加重肾脏损害25。 白细胞介素6也可由单核巨噬细胞和系膜细胞等合 成，在其他细胞因子存在时可直接刺激肾小球系膜组 织增生，导致肾小球纤维化，白细胞介素6亦可促使B 细胞增殖并产生大量IgE、IgA，沉积于肾小球系膜区 引起肾炎26。 白细胞介素12是目前已知特异性最强的能独立诱 导Th0向Th1细胞的分化与增殖的细胞因子27，可以诱 导Th1细胞的形成，避免Th2的活化，在调节Th1/Th2 的平衡起重要作用。 本组结果显示，过敏性紫癜组髓样分化蛋白2、髓 样细胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA的表达均显著高于正常对照组，白细胞介素12 mRNA的表达显著低于正常对照组，过敏性紫癜患儿 Toll样受体4 mRNA与髓样分化蛋白2、髓样细胞分化 因子88、白细胞介素1、白细胞介素6表达均呈正相关， 与白细胞介素12 mRNA表达呈负相关。过敏性紫癜有 肾损害组白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA较过敏 性紫癜无肾损害组过表达而白细胞介素12 mRNA低表 达，提示Toll样受体4经髓样细胞分化因子88依赖途径 的信号转导通路异常活化，导致细胞因子失调，白细 胞介素1、白细胞介素6 过度产生，白细胞介素12产 生不足致Th0向Th1分化减弱，Th2优势活化，引起 Th1/Th2失衡，参与过敏性紫癜发病，加重过敏性紫癜 的肾损伤。其具体机制尚需进一步的实验研究。 综上，过敏性紫癜患儿外周血单核细胞Toll样受体 4蛋白及Toll样受体4 mRNA、髓样分化蛋白2、髓样细 胞分化因子88、白细胞介素1、白细胞介素6 mRNA 表达明显升高，有肾损害组上述分子表达水平明显高 于无肾损害组；过敏性紫癜患儿外周血单核细胞白细 胞介素12 mRNA表达明显降低，过敏性紫癜有肾损害 组明显低于无肾损害组。Toll样受体4可能通过髓样细 付元，等. 紫癜性肾炎患者外周血单个核细胞Toll样受体3和4的信号转导途径 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org 9188 www.CRTER.org 胞分化因子88依赖信号转导途径介导过敏性紫癜及紫 癜性肾炎的免疫发病机制。 作者贡献：实验设计为常红，实验实施为付元、程娜、张 守青、陈秀霞、高兴娟，实验评估为常红、张秋业，资料收集为 付元。付元、常红成文、审校并对文章负责。文章作者均经过 系统培训，未使用盲法评估。 利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组 织直接或间接地经济或利益的赞助。 伦理要求：参与实验的患儿监护人自愿参加，对治疗过 程完全知情同意。 学术术语：Toll 样受体-是参与非特异性免疫(天然免疫)的 一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫 的桥梁。Toll 样受体是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别 来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的 物理屏障，如皮肤、黏膜等时，Toll 样受体可以识别它们并激 活机体产生免疫细胞应答。 作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密， 无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他 人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。 4 参考文献 References 1吴玉斌.过敏性紫癜性肾炎的治疗进展J.中国实用儿科学杂志， 2006,21(6):411-413. 2Hamdan JM, Barqawi MA. Henoch-Schonlein purpura in children.Influence of age on the incidence of nephritis and arthritis.Saudi Med J.2008;29(4):549-552. 3Gabriella M, Beniamina G, Alessandro D, et al. Renal transplantation in adults with Henoch-Schnlein purpura: long-term outcome. 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