细菌革兰氏染色法标准流程

细菌革兰氏染色法 1.1. 目的目的 为镜检细菌形态结构提供样本 2.2. 范围范围 适用于实验室常见细菌的抹片制备及染色 3.3. 采样对接人采样对接人 服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。 4.4. 设备和材料设备和材料 无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、 三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、 营养琼脂培养基、5石炭酸液；碘片； 碘化钾； 95酒精； 碱性复红粉末；显微镜；试管架；酒精灯； 接种环；药匙； 称量 纸；电子称；待试菌；灭菌蒸馏水； 吸水纸；香柏油；灭菌玻片、 100ul-1000ul 移液器、100ul-1000ul 移液吸头、打火机、擦镜纸、 计时器 5 5、采样及送样操作、采样及送样操作 采集采集：病料新鲜度无菌操作采样有目的进行采样保证组织 完整性独立存放到封口袋中并做好标记。 运输运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可， 不可冷冻。 样品的标识样品的标识 要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果 抽样日期及周龄、检测项目等内容。 6 6、细菌分离细菌分离 在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分） 用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上 （血琼脂、SS 琼脂、麦康凯琼脂、BP 琼脂等），于 371恒 温培养箱中培养 18-24h 后备用。 7 7、操作步骤操作步骤 7.17.1 细菌抹片的制备细菌抹片的制备 1 1、玻片准备、玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后， 能均匀展开，附着性好。如有残余油迹，可按下列方法处理： 2、 滴上 95酒精 23 滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯 上轻轻脱过几次。 3、 若上述方法未能去除油渍可再滴 12 滴冰醋酸，用纱布擦 净，再在酒精灯上轻轻通过。 4 4、抹片、抹片：所用材料不同，抹片方法亦有差异 5、 液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳液）可直接用 灭菌接种环取一环材料与玻片的中央均匀涂成适当大小的薄层。 6、 不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环 取少量生理盐水或蒸馏水，置与玻片中央，然后再用灭菌接种环取 少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 7、 组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀 取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂成一薄片。 8、 如有多个样品同时须要制成抹片，只要染色方法相同，亦可 以在同一张玻片上有序的排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片 上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留的样本片， 应贴好标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等 9、 上述涂片应让其自然干燥。 10、 固定：有两类固定方法 火焰固定火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒 精灯上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为 度）进行固定。 化学固定化学固定：血液、组织、脏器等抹片要作吉姆萨染色时，不 用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片侵入甲醇中 23 分钟，取出晾干：或在玻片上滴加数滴甲醇使其作用 23 分 钟后，自然挥发干燥，抹片如作瑞氏染色，则不必先作固定。染料 中含有甲醇，可以达到固定的目的。 7.27.2 染色具体操作：染色具体操作： 1.1. 涂片涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用 接种环以无菌操作分别从培养好的菌落（不同菌培养时间不同）斜 面上挑取少量菌于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹； 滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚 2 2 干燥干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒 精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过 长，以防标本烤枯而变形或者室温自然干燥。 3 3 固定固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上， 在酒精灯火焰处尽快的来回通过 2-3 次，共约 2-3 秒种，并不时以 载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过 60），放置待 冷后，进行染色。 4 4 初染初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫 1-2 滴，使染色液覆 盖涂片，染色约 1min， 5 5 水洗水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至 洗下的水呈无色为止。 6 6 媒染媒染：用 100-1000ul 移液枪吸取约 300ul 碘液滴在涂片薄 膜上，使染色液覆盖涂片，染色约 1min。 7 7 水洗水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至 洗下的水呈无色为止。 8 8 脱色脱色：斜置载玻片，滴加 95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现 紫色为止，大约需时 20-30S，随即水洗。 9 9 复染复染：在涂片薄膜上滴加复红染液 1-2 滴，使染色液覆盖涂 片，染色约 1min。 1010 水洗水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直 至洗下的水呈无色为止。 1111 干燥、观察干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜 下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观用油镜观 察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴 性菌。性菌。 8 8、注意事项、注意事项 .1 要求待检病料新鲜、无污染。 .2 整个试验操作过程注意无菌操作。 .3 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则 阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性 菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死 亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 .4 在进行各种染色时都应注意，当抹片滴上染色液后，不可直接 将剩余染液倾去，应用水连染液一起充分洗去，然后进行下一步骤， 以免发生沉渣黏附，影响染色效果 9 9、备注：（多种染色液的配制）、备注：（多种染色液的配制） 1、结晶紫染色液 ：结晶紫 1g 95%乙醇 20mL 1%草酸铵水溶液 80mL；将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 2、革兰氏碘液 ：碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶 解后，再加蒸馏水至 300mL。 3、可用 1：10 稀释石炭酸复红染色液作复染液。 4.龙胆紫原液：龙胆紫粉末 5g，加 95酒精 100ml。 5.石炭酸龙胆紫液：龙胆紫原液 10ml、5石炭酸液 90ml 混合过 虑过后备用。 6.脱色液：95%酒精 7.碘溶液（鲁格氏液）：碘片 1g、碘化钾 2g、蒸馏水 300ml 先将碘化钾 2g 加水 30ml 使其溶解，再将研碎的碘片 1g 加入， 完全溶解后再加足量的蒸馏水，使全量为 300ml。 稀释复红稀释复红