胚胎干细胞的应用

胚胎干细胞研究现状及应用前景 摘要： 作为一类既有自我更新能力，并具有多向分化潜能的细胞，胚胎干 细胞具有非常重要的理论研究意义和临床应用前景1。胚胎干细胞已被广泛用 于生命科学的许多领域, 它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。本 文主要概述了目前胚胎干细胞在基础研究及临床上应用的研究进展并展望了今 后研究的方向。 关键词： 胚胎干细胞 生物特性 克隆 应用 干细胞是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和 成体干细胞，特别是胚胎干细胞是当前国内外医学和生物学领域研究的重点。 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES Cells)是由早期胚胎内细胞团(Inner cell mass，ICM)(桑葚胚，囊胚)或原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。胚胎干细胞可以 在体外稳定的自我更新，可以在长时间继代培养后仍维持正常的二倍体染色体 结构；具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，在一定的条件 培养下，它可以无限增殖并分化成为全身 200 多种细胞类型，例如：人类 ES 细胞可以分化为肌细胞、神经细胞2、内皮细胞、造血干细胞、骨髓细胞等， 并可进一步形成机体所有组织、器官参与个体的发育过程，可称为是打开人类 胚胎发育大门的一把“万能钥匙”。 1.胚胎干细胞的生物学特性 1.1 胚胎干细胞的形态生化特性 胚胎干细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核 质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核 糖体外，其他细胞器很少；体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起， 无明显细胞界限。细胞的染色体均为稳定的二倍体核型。 胚胎干细胞表达早期胚胎细胞的表面抗原，转录因子 Oct- 4 为目前广泛用 于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。研究发现，它 最早表达于胚胎 8 细胞时期，一直到细胞发育至桑椹胚时期，在每个卵裂球中 都可检测到大量的 Oct- 4 的表达产物，这之后 Oct- 4 的表达局限于内细胞团细 胞。 由此可见，Oct- 4 为细胞是否具有多能性的一个标记分子。另外，还有一 些其他的标记分子，如碱性磷酸酶、Genesis、TRA- 1- 60、TRA- 1- 81、CD30 等。 1.2 胚胎干细胞的增值 胚胎干细胞能够自我更新而不分化，即经过不断地细胞分裂，增加干细胞 的数量却始终保持着未分化状态。胚胎干细胞的分裂方式有两种：对称性细胞 分裂与不对称性细胞分裂。所谓对称性细胞分裂是指干细胞每经过一次细胞分 裂周期后，产生与母细胞相同的两个子代干细胞；而不对称性细胞分裂是指干 细胞每经过一次细胞分裂周期后的两个子代细胞，其中一个仍然维持干细胞状 态，另一个则形成干细胞和终末分化细胞的中间细胞类型，称祖细胞,祖细胞则 失去自我更新能力，但可以分化成多种组织细胞。胚胎干细胞究竟采取那种分 裂方式，与它所处的微环境有关，在自我更新的组织中干细胞即可分化成两个 干细胞，又可形成两个分化细胞；当组织处于稳定状态时，往往进行不对称分 裂。目前，科学家们正致力于明确在什么样的培养环境中，使胚胎干细胞可以 成百倍的分裂而不分化。 1.3 胚胎干细胞的定向分化 当前，胚胎干细胞研究的一个主要目的就是按照人的意愿来控制人的干细 胞株向特定的细胞转化，并将这些转化的细胞应用于临床治疗。目前，研究人 员在胚胎干细胞定向分化中已取得了很大进展，如现在已经可以使人的胚胎干 细胞定向分化为神经元、心肌细胞、血管内皮细胞、类胰岛细胞等。很显然， 人们一旦掌握了胚胎干细胞定向分化的规律，必然引起生物医学领域的一场重 大革命3。 2.胚胎干细胞的研究状况 2.1 国外胚胎干细胞的研究状况 目前国际干细胞研究有 4 大热点：胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞 的分子机制；成体干细胞横向分化的条件；各种组织的成体干细胞库的建立及 临床治疗试验以及细胞移植的免疫排斥问题。 国外已取得令人欣喜的成果有： 成功建立胚胎干细胞体外培养系统，并发现人的血液干细胞可以横向分化为肝 脏、神经等组织的细胞。在各种干细胞的研究与应用中，胚胎干细胞（简称 ES 细胞）最引人注目。最新的研究表明，利用胚胎干细胞自我更新、高度增殖和 多向分化的能力，结合现代生物医学及工程技术，有可能使人类组织或器官的 修复和替代的美梦成真。这个领域的研究几乎涉及人体所有的重要组织和器官， 也涉及人类面临的大多数医学难题，如成分输血、意外损伤患者的植皮、关节 置换，糖尿病患者的胰腺植入、心脏病患者的瓣膜置换、癌症患者的手术切除 后组织或器官的替代，大剂量放化疗后的造血与免疫功能重建，肝、肾等重要 器官损伤或功能衰竭后的置换，部分遗传缺陷性疾病的治疗等。 由于研究对象来源的匮乏（主要取自人工流产的极早期胚胎，或是施行试 管婴儿术时所剩余的胚胎）以及伦理道德的约束，人胚胎干细胞的体外研究一 直是空白。这种状况在 1998 年末被打破。美国 Wisconsin 大学科学家 Thomson 借助 G1、2 和 G2、2 培养基，解决了早期胚胎对输卵管环境的依赖 性问题，从而将新鲜或冰冻的人体外受精卵由 48 细胞阶段培养至胚泡期， 经分离内细胞团后逐渐传代建立了人胚胎干细胞系。 美国科学家 John 从人原 始生殖细胞中建立了与人胚胎干细胞功能个似的多能干细胞系胚胎生殖 细胞系。这两个小组的研究结果在科学和美国科学院院报上一经刊出， 立即在科学界引起极大的震撼，不仅掀起了新一轮的胚胎干细胞研究热潮，而 且由于科学家利用人类干细胞系诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞和心肌干细 胞获得成功，使得胚胎干细胞应用于临床的研究产生了突破性进展。2008 年 1 月美国加利福尼亚州从事干细胞研究的 Stemagen 公司采用克隆多利的技术来 建立人体晶胚，首次宣布由人体细胞成功克隆人体胚胎，虽然这些比针头还要 小的晶胚细胞只存活了 5 天时间，它们却被视为治疗阿尔茨海默症、帕金森氏 症等疾病的一个里程碑。 目前，科学家对胚胎干细胞定向诱导分化的机制尚不清楚，即还不明白胚 胎干细胞接受谁的“命令”，此时分化为造血干细胞，而彼时又分化为神经干 细胞或别的什么干细胞。 这是干细胞工程进一步研究与应用面临的最大困扰。 在胚胎干细胞向各种细胞分化的研究模型中，向造血细胞的定向诱导分化是最 佳模型之一。为此，一段时间以来，我国科学家对造血干细胞的研究与应用投 入了较大的精力，也取得了一些突出成绩。 2.2 国内胚胎干细胞的研究状况 2002 年重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所完成了中国首例囊胚胎培养技术。 该技术不仅大提高了试管婴儿的妊娠成功率，还有效地降低多胞胎发生率。美 国哈佛大学医学院正与重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所合作，人工共同研究 干细胞的分化，为“克隆”人体器官创造条件。我国在“治疗性克隆”研究领 域获得重大突破，“治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课 题分为上、中、下游三块，上海市转基因研究中心成国祥博士负责上游研究， 上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其 整体目标是，用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其 发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织 或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移 植到病人身上。利用这种方法，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难 的免疫排斥反应，同时还使得组织或器官有了良好的、充分的来源。目前，由 上海市转基因研究中心负责的上游研究工作，即把病人的体细胞移到去核的卵 母细胞并经一系列的处理发育至囊胚取得成功。这个中心创建的三种技术路线 方法，即“体细胞克隆哺乳动物的制备方法”、“获得治疗性克隆植入前的制 备方法”以及“用于治疗性克隆的人体细胞组织器官保存方法”均已收到国家 知识产权局同意专利申请的受理通知。 2009 年 2 月 2 日山东省干细胞工程技术研究中心宣布首次成功克隆人类 囊胚，此研究选择了健康卵细胞志愿捐献者 12 人，经过促排卵共获得 135 枚 卵细胞，其中 77 枚卵细胞进行了预实验，58 枚卵细胞用于实验，最终成功获 取囊胚 5 枚。其中 4 枚囊胚的供体细胞来源于正常人皮肤纤维细胞，1 枚来源 于帕金森患者外周血淋巴细胞。因而，揭示了在构建胚胎发育过程中的部分科 学和技术问题，这使治疗性克隆研究向前迈进了一大步。国内科学家普遍认为， 我国的干细胞研究目前与国外先进水平非常接近，因此在国际上“挤占”一席 之地是很有希望的。如果看准时机，通过政府出面调控企业适时介入，无论是 学科进步还是产业化发展的前景都十分可观。我国政府已经将干细胞研究列入 “973”项目、国家自然科学基金重点项目中4。 3.胚胎干细胞的应用进展 3.1 ES 细胞诱导分化为表皮样干细胞及其在皮肤修复方面的应用 目前临床上对烧伤或创伤患者进行整形修复时主要是依靠自体皮肤的移植, 但对于大面积严重烧伤或损伤的患者根本无法移植, 只能让患者形成永久性疤 痕。最早研究的永久性皮肤替代物为表皮细胞膜片, 主要是采用自体或异体的 角质形成细胞, 在体外培养形成表皮细胞膜片, 用来覆盖皮肤缺损, 其不能形成 皮肤附属结构。Bagutti 等用悬滴培养法培养小鼠 ES 细胞形成拟胚体, 于第 215 天及 21 天分别有细胞角蛋白 CK8 和 CK19、CK10 和 CK14 的表达, 提示 ES 具有向表皮方向分化的潜能。撒亚莲等研究结果示人类 ES 细胞源性的表皮 样干细胞具有分化为角化复层上皮、毛囊样、皮脂腺样和汗腺样结构的潜能, 在 ES 细胞向皮肤细胞诱导分化方面取得一定进展。刘爱军等研究结果表明移 植到创面的 ES 源性表皮干细胞存活, 并向表皮分化, 创面完全愈合后, 检测出 有特异性标记物的角化复层上皮、毛囊干细胞和汗腺, 提示 ES 细胞源性表皮 干细胞具有分化为毛囊和汗腺等结构的潜能, 说明把 ES 细胞源性表皮干细胞 直接植入到全层皮肤缺损创面, 可能对修复表皮及皮肤附属结构起重要作用。 以上实验成功地显示 ES 细胞具有向表皮样细胞诱导分化的潜能, 并有希望应用 于临床, 移植到烧伤或创伤患者皮肤进行整形修复。 3.2 ES 细胞诱导分化为神经细胞及其在神经系统疾病中的应用 许多神经系统疾病实际上是由于神经细胞的缺失所致, 这些细胞如果得不 到新生细胞的补充, 所形成的疾病就不可能治愈。2006 年, Ueno 提出了羊膜基 质层基础上的胚胎干细胞诱导诱导方法, 将打散的鼠 ES 细胞种植在明胶包被 的人类羊膜基质层上, 在无血清培养基里培养了 1 周之后形成集落, 里面包含了 大量 Nestin 阳性细胞和 NCAM 阳性细胞。通过此法可诱导生成各种类型的神 经细胞, 包括多巴胺神经元、运动神经元和视网膜色素上皮细胞。李彬等用人 类 ES 细胞高效地分化得到了神经前体细胞。这种神经前体细胞具有多能性及 与体内神经发育相似的模式和基因表达变化。将 ES 细胞诱导分化为神经细胞 的研究, 不但可以解释人类神经系统发育过程中的复杂事件, 还可以提供可能的 供体细胞来源用于细胞替代性治疗。在早期的 ES 细胞源的神经细胞移植实验 中,植入鼠类模型脑中的神经元不仅具有功能活性, 而且整合到宿主的脑中, 在 某些个案中甚至改善了神经退行性疾病的症状。Cumm ings 等将人胚胎脑神经 干细胞球移植到鼠损伤脊髓处, 电镜观察到移植细胞与宿主神经元之间有突触 形成, 大鼠的运动功能也相应恢复。Lu 等实验也证明移植神经干细胞能促进损 伤脊髓功能恢复。以上关于 ES 细胞的研究, 为神经系统疾病的治疗, 提供了新 的有效的方法, 尤其是一些伴随脑或脊髓相应部位的特定神经元死亡的老年性 疾病, 通过诱导胚胎干细胞分化形成新的神经组织细胞并进行移植修复, 有望治 愈这些疾病。 3.3 ES 细胞诱导分化为造血干细胞及其在造血系统疾病中的应用 如今对于造血系统功能异常, 如再生障碍性贫血、白血病等, 随着医学进展, 很多病例得到一定程度的缓解, 但仍有相当的患者不能治愈, 抑或出现治疗并发 症等。胚胎干细胞定向诱导为造血干细胞的研究成果, 可能为临床提供新的有 效的治疗方法。人们先后采用了悬浮培养、半固体培养基中原位诱导、辅助细 胞共培养以及分阶段诱导等多种方法成功地将 ES 细胞在体外诱导分化为造血 各系细胞。张绪超等通过对含人 AGM 区基质细胞培养体系定向诱导 ES 细胞 为造血干细胞的实验研究, 得出人胚早期 AGM 区基质细胞能促进小鼠 ES 细胞 定向分化为造血干细胞的结论, 为研究 ES 细胞分化为造血干细胞的分子机制提 供了实验模型。关于 ES 细胞诱导分化为造血干细胞最诱人的前景和用途就是 为细胞移植提供原材料, 为血液病的治疗提供了新的方法。 3.4 ES 细胞诱导分化为生殖细胞及其在生殖系统方面的应用 2003 年 5 月, Science 的一篇报道提出鼠 ES 细胞体外可分化为卵母细胞, 此后共有三个实验室从小鼠 ES 细胞得到配子样细胞, 体外能产生雄性原始生殖 细胞和单倍体的雄性配子, 在某种程度上表现出具有配子的功能。ES 细胞可以 诱导分化为包括生殖细胞在内的所有细胞类型。ES 细胞在体外一定条件下, 可 以发生减数分裂, 形成精子和卵子, 这为生殖遗传修饰研究提供了一个有用的细 胞培养体系, 对临床生殖医学的发展具有重要作用。 3.5 ES 细胞诱导分化为心肌细胞及其在心血管系统方面的应用 由心肌损伤所致多种心脏疾病, 其共同特点是具有完整收缩功能的心肌细 胞的数量相对或绝对减少, 治疗这些疾病的关键是增加具有完整收缩功能的心 肌细胞的数量, 诱导 ES 细胞分化为心肌细胞,为其提供可能。Norstrom等用拟 胚体( EB )培养方法获得心肌样细胞。Yoon 等发现悬滴培养结合 5-杂氮胞苷处 理可大幅度提高人类 ES 细胞向心肌细胞分化的效率。研究发现, ES 细胞用于 急性心肌梗死、晚期冠心病, 慢性心力衰竭病人, 有改善心肌灌注和/或心肌收 缩的潜能。Cai 等将小鼠 ES 细胞源的心肌细胞直接注射到心梗一周后的大鼠的 心脏瘢痕组织边缘, 4 周后通过超声心动图评估心功能, 发现显著改善了心室功 能, 免疫荧光检测到心肌特异蛋白的表达。ES 细胞向心肌细胞分化的研究将为 冠心病、心脏病、心力衰竭等心脏疾病患者带来希望。 3.6 ES 细胞诱导分化为肝细胞及其在肝脏疾病治疗中的应用 胚胎干细胞在特定培养条件下, 经 specific progeny-FGF, HGF 等细胞因子 作用可定向分化为肝细胞。Hamazaki 等首先采用细胞因子分阶段诱导的方法检 测了拟胚体诱导分化为肝细胞的可能性, 他们将体外培养 5 天的拟胚体接入 I 型 胶原包被的培养板中, 贴壁 3 天后先后添加 FGF1、HGF 和 OSM、Dex、ITS 分 别作为早、中、晚期诱导剂, 连续诱导 9 天后检测到 G6p 和 TAT 两种成熟肝细 胞基因的表达。Ruhnke 等将大鼠 ES 细胞培养在 M atr igel 包被的盖玻片上, 采 用含 FGF4 的培养液进行肝细胞的直接诱导分化, 诱导 21 天后, 免疫组化表明 其表达 CK18、a-lbum in、AFP、AAT 等蛋白。Lavon 等用拟胚体培养方法获 得肝样细胞。将肝特异的白蛋白基因启动子与 eGFP 基因融合, 再将此 ALB- eGFP 融合基因转染人 ES 细胞。EB 培养 20 天后, 检测到 eGFP 阳性细胞, 同时 表达白蛋白。这些实验都显示 ES 细胞可以诱导分化为干细胞, 可用于肝硬化、 肝坏死等肝功能衰竭的细胞移植治疗, 为肝脏疾病患者带来福音。 3.7 ES 细胞诱导分化为软骨细胞成骨细胞及其在骨骼疾病治疗中的应用 临床上常常见到因软骨数量不足或功能缺陷而引起的疾病, 如软骨发育不 全、关节炎类软骨疾病等, 由于没有神经和血管分布, 软骨难以自我修复。ES 细胞在一定条件下, 能诱导分化为软骨细胞, 有希望解决手术难以治愈的疾病。 Hwang 等用 EB 培养方法高效地自人类 ES 细胞获得间充质样细胞。当这些细 胞包埋在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸( RGD )修饰的聚乙二醇水凝胶中, 并结合 TGF-l 处理时, 可观察到新形成的软骨。该软骨中有嗜碱性细胞外基质沉积, 软 骨特异的分子如型胶原、Aggrecan 和连接蛋白( linkprotein)等的表达明显上调。 将 ES 细胞诱导分化为软骨细胞, 可以为严重的软骨疾病患者提供更多的可选择 的治疗方法。K arp 等首次尝试不用 EB 的方法, 将 ES 细胞培养 4 5d 后, 将得 到的单层细胞加入一定浓度 Dex、-磷酸甘油和维生素 C 进行诱导, 35d 后形 成骨结节( 39.1 17.8)个/万个细胞。将 ES 细胞诱导分化为成骨细胞奠定了其 在骨组织修复中的基础。 3.8 ES 细胞诱导分化为内分泌细胞及其在临床中的应用 Vaca 等向小鼠拟胚体培养液中添加胎鼠胰腺培养介质, 其可溶性因子诱导 胚胎干细胞分化成具有 B 细胞标志和功能的细胞, 并恢复糖尿病小鼠血糖。D Amour 模拟体内胰腺发生环境诱导人类 ES 细胞表达内分泌激素, 得到的胰岛素 表达细胞具有与胎儿 B 细胞相似的功能, 在多种内分泌刺激下, 可释放胰岛素 和 C 肽。更多试验在试图将 ES 细胞诱导分化为胰岛 B 细胞, 并移植入糖尿病 患者体内, 如果能成功应用于临床, 可能会使由于胰岛素绝对缺乏的患者得到根 本治愈。徐伟光等将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养, 定向诱导其分化为上皮 样干细胞克隆, 将此生长有上皮样干细胞克隆的人羊膜将小鼠新鲜垂体包裹, 植 入羊膜共培养, 发现有垂体样细胞形成。此实验表明胚胎干细胞有分化为垂体 样细胞的潜能, 有望用于垂体功能低下的治疗。 3.9 ES 细胞诱导分化为甲状腺细胞及其在甲状腺功能减退症的治疗中的应 用价值 Lin 等进行了 ES 细胞向甲状腺细胞定向分化的研究, 试验证明, ES 细胞有 能力在体外诱导分化成甲状腺细胞。可能开创细胞替代治疗甲状腺功能减退症 等疾病。 3.10 ES 细胞在抗癌方面的应用 据自然杂志网站 2006 年 11 月 10 日报道, 美国肯塔基州路易斯维尔大 学的首席研究员约翰伊顿发现, 晶胚和肿瘤都呈球形生长, 营养来源一致,它 们的一些蛋白质也是相同的。由于晶胚中包含着胚胎干细胞, 因此伊顿认为, 一 种能激发肌体对胚胎干细胞产生免疫反应的疫苗也能激发肌体抗击肿瘤细胞。 研究小组正在寻找胚胎干细胞中起作用的分子, 以便研制出有效和安全的抗癌 疫苗5。 4 胚胎干细胞的应用前景 41 克隆动物 胚胎干细胞在理论上讲可以无限传代和增殖而不失其正常的二倍体基因型 和表现型，所以可以对其进行体外培养至早期胚胎进行胚胎移植，在短期内可 获得大量基因型和表现型完全相同的个体，这在保护珍稀野生动物方面有着重 要意义。还可对胚胎干细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动 物，有可能创造新的物种。 42 转基因动物 利用转基因技术，将控制人们所需性状的基因导入到胚胎干细胞中，在体 外适宜条件下进行细胞培养。在对其诱导分化，产生一个新的个体即转基因生 物体，让其表现人们所需要的性状。如将药用蛋白基因与乳腺蛋白质基因的启 动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的胚胎干细 胞中，然后，将体外培养胚胎干细胞得到的早期胚胎移植到受体子宫内，使其 生长发育成转基因动物。该转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来 生产所需要的药品。因而使其成为“乳腺生物反应器”或“乳房生物反应器”。 43 器官移植 对胚胎干细胞进行体外培养，经过诱导分化，形成相应的组织和器官可 以用于组织器官的移植，使体内病变的组织器官得以修复并恢复正常功能。而 且用自体的细胞进行培养后移植还可以避免异体移植所带来的免疫排斥问题。 目前，在动物实验方面，用 ES 细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈 肝衰竭、心衰竭、成骨不良等疑难病症。也许在不久的将来，当我们的身体某 一类细胞功能出现异常或退化时，就可以通过诱导 Es 细胞定向分化来及时修补。 4.4 胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料 ES 细胞在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。在培养液中 加入分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导 ES 细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了 有效的手段。 4.5 胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究 由于 ES 细胞可以分化为胚胎的内胚层、中胚层和外胚层中任何一类细胞， 于是可以将带有遗传标记的 ES 细胞注入早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染 色，了解 ES 细胞的分化特点，这就为研究胚胎发育过程中的细胞分化及组织 和器官形成的规律，进而研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因 素等提供了可能。 4.6 胚胎干细胞用于治疗疾病 目前，胚胎干细胞已经在多种疾病的治疗中发挥着重要的作用。如帕金森 氏综合症是以某些运动障碍(静止性震颇、肌强直、运动迟缓和姿势反射丧失) 为临床特征的一组疾病。发病是由于多巴胺神经系统病变或损伤引起原发性多 巴胺缺损。正常健康状态下，乙酰胆碱和多巴胺的效应之间存在一种平衡状态。 患病时多巴胺减少，打破平衡，导致病人活动障碍。所以可以在体外培养胚胎 干细胞，并定向诱导其分化成生成多巴胺的神经细胞，可望用于治疗帕金森氏 综合症6。 5存在的问题 5.1 体外培养 ES 细胞要求既能快速无限增殖, 又呈未分化状态。如何平衡 这一对矛盾, 必须筛选适宜的培养条件。目前科学家虽已建立小鼠细胞系, 但家 畜和人类仅得到类细胞系, 即便是类细胞系, 建系成功率也不高, 家畜、人类细 胞系建立的最佳条件仍无定论。 5.2 ES 细胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用 ES 细胞进 行治疗前必须首先体外诱导 ES 细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀 基因, 当移植的细胞向肿瘤发展时, 自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。但如何 诱导 ES 细胞定向分化成单一类型的分化细胞, 是至今仍未解决的难题。令人高 兴的是, 科学家相信只要将 ES 细胞诱导分化为所需组织细胞的前体( 祖细胞)移 植到适当的环境中就能够产生所需组织, 并与周围细胞及胞外基质相互作用而 有机地整合至受者组织中。 5.3 由 ES 细胞在体外发育成一完整的器官, 尤其是象心、肝、肺等大型精 细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂 的三维过程, 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育 完整的来自自然机体的器官, 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法 做到, 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题9。 参考文献 1秦洁，郭新等.胚胎干细胞分化过程中的表观遗传调控J生命科学.2007,6(3): 316. 2 Igelmund，Fleischman B K，Fisher I R，etal. Action potential propagation failures in long- term recordings from embryonic stem cell- derived cardiomyocytes in tissue cultureJ.Pflugers Arch，1999，437(5)：669- 679. 摘要翻译：三维细胞聚集（胚体，EBS），其中包含集群自发跳动的心肌细胞均 来自永久性小鼠胚胎干细胞（ES）。人动作电位心肌集群外录音使用永久安装 的银线电极和微电极阵列集成到培养皿的底部。这些技术允许从单个胚细胞培 养条件下长期录音（几个星期）。正常的电活动包括定期的扣球 0.5-5 赫兹的 频率。然而，大多数 EBS（87）自发地发展，因为间歇性的行动在狭窄的通 路连接跳动地区较大的潜在传播块临时或持久性的复杂活动模式。相似的传播 块也可能是可逆的定期扣球尼莫地平（NDP）分化诱导。此外起搏器活动放缓， NDP（20-200 nm）的诱发动作电位的频率逐步减少在录制现场。从酶解分离出 胚胎干细胞衍生的心肌穿孔膜片钳记录显示，类似的活动模式不会出现在单细 胞水平。我们表明，这种新方法可以提供一个有用的工具，在体外的 chronotropy 研究和传播失败的房室传导阻滞相似现象。 39蔡琳，李菲菲.胚胎干细胞研究进展J大连医科大学学报.2007,6(3): 310-311. 4燕卫东，吴春华.胚胎干细胞的研究进展J赤峰学院学报（自然科学版）. 2010,2(2):27-28. 5王一子，文静等.胚胎干细胞的研究进展及应用前景J北京生物医学工程. 2008,8（4）：436-438. 6韩海荣.胚胎干细胞的应用前景J中国校外教育.2009(8):462. Progression in the study of embryonic stem cell and its future application Abstract: Stem cells are characterized by extensive self-renewal and the ability to differentiate into various cell-type specific progeny. They have been widely used in m any aspects of life science. And their potential medical applications become a research hot- spot throughout the world. This paper summarizes the current embryonic stem cells in basic research and clinical application of research and has an outlook on future research directions. Keywords: Stem cells Biological characteristics Clone Application 1.胚胎干细胞的生物学特性 1.1 胚胎干细胞的形态生化特性 胚胎干细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核 质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核 糖体外，其他细胞器很少；体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起， 无明显细胞界限。细胞的染色体均为稳定的二倍体核型。 胚胎干细胞表达早期胚胎细胞的表面抗原，转录因子 Oct- 4 为目前广泛用 于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。研究发现，它 最早表达于胚胎 8 细胞时期，一直到细胞发育至桑椹胚时期，在每个卵裂球中 都可检测到大量的 Oct- 4 的表达产物，这之后 Oct- 4 的表达局限于内细胞团细 胞。 由此可见，Oct- 4 为细胞是否具有多能性的一个标记分子。另外，还有一 些其他的标记分子，如碱性磷酸酶、Genesis、TRA- 1- 60、TRA- 1- 81、CD30 等。 1.2 胚胎干细胞的增值 胚胎干细胞能够自我更新而不分化，即经过不断地细胞分裂，增加干细胞 的数量却始终保持着未分化状态。胚胎干细胞的分裂方式有两种：对称性细胞 分裂与不对称性细胞分裂。所谓对称性细胞分裂是指干细胞每经过一次细胞分 裂周期后，产生与母细胞相同的两个子代干细胞；而不对称性细胞分裂是指干 细胞每经过一次细胞分裂周期后的两个子代细胞，其中一个仍然维持干细胞状 态，另一个则形成干细胞和终末分化细胞的中间细胞类型，称祖细胞,祖细胞则 失去自我更新能力，但可以分化成多种组织细胞。胚胎干细胞究竟采取那种分 裂方式，与它所处的微环境有关，在自我更新的组织中干细胞即可分化成两个 干细胞，又可形成两个分化细胞；当组织处于稳定状态时，往往进行不对称分 裂。目前，科学家们正致力于明确在什么样的培养环境中，使胚胎干细胞可以 成百倍的分裂而不分化。 1.3 胚胎干细胞的定向分化 当前，胚胎干细胞研究的一个主要目的就是按照人的意愿来控制人的干细 胞株向特定的细胞转化，并将这些转化的细胞应用于临床治疗。目前，研究人 员在胚胎干细胞定向分化中已取得了很大进展，如现在已经可以使人的胚胎干 细胞定向分化为神经元、心肌细胞、血管内皮细胞、类胰岛细胞等。很显然， 人们一旦掌握了胚胎干细胞定向分化的规律，必然引起生物医学领域的一场重 大革命3。 2.胚胎干细胞的研究状况 2.1 国外胚胎干细胞的研究状况 目前国际干细胞研究有 4 大热点：胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞 的分子机制；成体干细胞横向分化的条件；各种组织的成体干细胞库的建立及 临床治疗试验以及细胞移植的免疫排斥问题。 国外已取得令人欣喜的成果有： 成功建立胚胎干细胞体外培养系统，并发现人的血液干细胞可以横向分化为肝 脏、神经等组织的细胞。在各种干细胞的研究与应用中，胚胎干细胞（简称 ES 细胞）最引人注目。最新的研究表明，利用胚胎干细胞自我更新、高度增殖和 多向分化的能力，结合现代生物医学及工程技术，有可能使人类组织或器官的 修复和替代的美梦成真。这个领域的研究几乎涉及人体所有的重要组织和器官， 也涉及人类面临的大多数医学难题，如成分输血、意外损伤患者的植皮、关节 置换，糖尿病患者的胰腺植入、心脏病患者的瓣膜置换、癌症患者的手术切除 后组织或器官的替代，大剂量放化疗后的造血与免疫功能重建，肝、肾等重要 器官损伤或功能衰竭后的置换，部分遗传缺陷性疾病的治疗等。 由于研究对象来源的匮乏（主要取自人工流产的极早期胚胎，或是施行试 管婴儿术时所剩余的胚胎）以及伦理道德的约束，人胚胎干细胞的体外研究一 直是空白。这种状况在 1998 年末被打破。美国 Wisconsin 大学科学家 Thomson 借助 G1、2 和 G2、2 培养基，解决了早期胚胎对输卵管环境的依赖 性问题，从而将新鲜或冰冻的人体外受精卵由 48 细胞阶段培养至胚泡期， 经分离内细胞团后逐渐传代建立了人胚胎干细胞系。 美国科学家 John 从人原 始生殖细胞中建立了与人胚胎干细胞功能个似的多能干细胞系胚胎生殖 细胞系。这两个小组的研究结果在科学和美国科学院院报上一经刊出， 立即在科学界引起极大的震撼，不仅掀起了新一轮的胚胎干细胞研究热潮，而 且由于科学家利用人类干细胞系诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞和心肌干细 胞获得成功，使得胚胎干细胞应用于临床的研究产生了突破性进展。2008 年 1 月美国加利福尼亚州从事干细胞研究的 Stemagen 公司采用克隆多利的技术来 建立人体晶胚，首次宣布由人体细胞成功克隆人体胚胎，虽然这些比针头还要 小的晶胚细胞只存活了 5 天时间，它们却被视为治疗阿尔茨海默症、帕金森氏 症等疾病的一个里程碑。 目前，科学家对胚胎干细胞定向诱导分化的机制尚不清楚，即还不明白胚 胎干细胞接受谁的“命令”，此时分化为造血干细胞，而彼时又分化为神经干 细胞或别的什么干细胞。 这是干细胞工程进一步研究与应用面临的最大困扰。 在胚胎干细胞向各种细胞分化的研究模型中，向造血细胞的定向诱导分化是最 佳模型之一。为此，一段时间以来，我国科学家对造血干细胞的研究与应用投 入了较大的精力，也取得了一些突出成绩。 2.2 国内胚胎干细胞的研究状况 2002 年重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所完成了中国首例囊胚胎培养技术。 该技术不仅大提高了试管婴儿的妊娠成功率，还有效地降低多胞胎发生率。美 国哈佛大学医学院正与重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所合作，人工共同研究 干细胞的分化，为“克隆”人体器官创造条件。我国在“治疗性克隆”研究领 域获得重大突破，“治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课 题分为上、中、下游三块，上海市转基因研究中心成国祥博士负责上游研究， 上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其 整体目标是，用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其 发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织 或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移 植到病人身上。利用这种方法，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难 的免疫排斥反应，同时还使得组织或器官有了良好的、充分的来源。目前，由 上海市转基因研究中心负责的上游研究工作，即把病人的体细胞移到去核的卵 母细胞并经一系列的处理发育至囊胚取得成功。这个中心创建的三种技术路线 方法，即“体细胞克隆哺乳动物的制备方法”、“获得治疗性克隆植入前的制 备方法”以及“用于治疗性克隆的人体细胞组织器官保存方法”均已收到国家 知识产权局同意专利申请的受理通知。 2009 年 2 月 2 日山东省干细胞工程技术研究中心宣布首次成功克隆人类 囊胚，此研究选择了健康卵细胞志愿捐献者 12 人，经过促排卵共获得 135 枚 卵细胞，其中 77 枚卵细胞进行了预实验，58 枚卵细胞用于实验，最终成功获 取囊胚 5 枚。其中 4 枚囊胚的供体细胞来源于正常人皮肤纤维细胞，1 枚来源 于帕金森患者外周血淋巴细胞。因而，揭示了在构建胚胎发育过程中的部分科 学和技术问题，这使治疗性克隆研究向前迈进了一大步。国内科学家普遍认为， 我国的干细胞研究目前与国外先进水平非常接近，因此在国际上“挤占”一席 之地是很有希望的。如果看准时机，通过政府出面调控企业适时介入，无论是 学科进步还是产业化发展的前景都十分可观。我国政府已经将干细胞研究列入 “973”项目、国家自然科学基金重点项目中4。 3.胚胎干细胞的应用进展 3.1 ES 细胞诱导分化为表皮样干细胞及其在皮肤修复方面的应用 目前临床上对烧伤或创伤患者进行整形修复时主要是依靠自体皮肤的移植, 但对于大面积严重烧伤或损伤的患者根本无法移植, 只能让患者形成永久性疤 痕。最早研究的永久性皮肤替代物为表皮细胞膜片, 主要是采用自体或异体的 角质形成细胞, 在体外培养形成表皮细胞膜片, 用来覆盖皮肤缺损, 其不能形成 皮肤附属结构。Bagutti 等用悬滴培养法培养小鼠 ES 细胞形成拟胚体, 于第 215 天及 21 天分别有细胞角蛋白 CK8 和 CK19、CK10 和 CK14 的表达, 提示 ES 具有向表皮方向分化的潜能。撒亚莲等研究结果示人类 ES 细胞源性的表皮 样干细胞具有分化为角化复层上皮、毛囊样、皮脂腺样和汗腺样结构的潜能, 在 ES 细胞向皮肤细胞诱导分化方面取得一定进展。刘爱军等研究结果表明移 植到创面的 ES 源性表皮干细胞存活, 并向表皮分化, 创面完全愈合后, 检测出 有特异性标记物的角化复层上皮、毛囊干细胞和汗腺, 提示 ES 细胞源性表皮 干细胞具有分化为毛囊和汗腺等结构的潜能, 说明把 ES 细胞源性表皮干细胞 直接植入到全层皮肤缺损创面, 可能对修复表皮及皮肤附属结构起重要作用。 以上实验成功地显示 ES 细胞具有向表皮样细胞诱导分化的潜能, 并有希望应用 于临床, 移植到烧伤或创伤患者皮肤进行整形修复。 3.2 ES 细胞诱导分化为神经细胞及其在神经系统疾病中的应用 许多神经系统疾病实际上是由于神经细胞的缺失所致, 这些细胞如果得不 到新生细胞的补充, 所形成的疾病就不可能治愈。2006 年, Ueno 提出了羊膜基 质层基础上的胚胎干细胞诱导诱导方法, 将打散的鼠 ES 细胞种植在明胶包被 的人类羊膜基质层上, 在无血清培养基里培养了 1 周之后形成集落, 里面包含了 大量 Nestin 阳性细胞和 NCAM 阳性细胞。通过此法可诱导生成各种类型的神 经细胞, 包括多巴胺神经元、运动神经元和视网膜色素上皮细胞。李彬等用人 类 ES 细胞高效地分化得到了神经前体细胞。这种神经前体细胞具有多能性及 与体内神经发育相似的模式和基因表达变化。将 ES 细胞诱导分化为神经细胞 的研究, 不但可以解释人类神经系统发育过程中的复杂事件, 还可以提供可能的 供体细胞来源用于细胞替代性治疗。在早期的 ES 细胞源的神经细胞移植实验 中,植入鼠类模型脑中的神经元不仅具有功能活性, 而且整合到宿主的脑中, 在 某些个案中甚至改善了神经退行性疾病的症状。Cumm ings 等将人胚胎脑神经 干细胞球移植到鼠损伤脊髓处, 电镜观察到移植细胞与宿主神经元之间有突触 形成, 大鼠的运动功能也相应恢复。Lu 等实验也证明移植神经干细胞能促进损 伤脊髓功能恢复。以上关于 ES 细胞的研究, 为神经系统疾病的治疗, 提供了新 的有效的方法, 尤其是一些伴随脑或脊髓相应部位的特定神经元死亡的老年性 疾病, 通过诱导胚胎干细胞分化形成新的神经组织细胞并进行移植修复, 有望治 愈这些疾病。 3.3 ES 细胞诱导分化为造血干细胞及其在造血系统疾病中的应用 如今对于造血系统功能异常, 如再生障碍性贫血、白血病等, 随着医学进展, 很多病例得到一定程度的缓解, 但仍有相当的患者不能治愈, 抑或出现治疗并发 症等。胚胎干细胞定向诱导为造血干细胞的研究成果, 可能为临床提供新的有 效的治疗方法。人们先后采用了悬浮培养、半固体培养基中原位诱导、辅助细 胞共培养以及分阶段诱导等多种方法成功地将 ES 细胞在体外诱导分化为造血 各系细胞。张绪超等通过对含人 AGM 区基质细胞培养体系定向诱导 ES 细胞 为造血干细胞的实验研究, 得出人胚早期 AGM 区基质细胞能促进小鼠 ES 细胞 定向分化为造血干细胞的结论, 为研究 ES 细胞分化为造血干细胞的分子机制提 供了实验模型。关于 ES 细胞诱导分化为造血干细胞最诱人的前景和用途就是 为细胞移植提供原材料, 为血液病的治疗提供了新的方法。 3.4 ES 细胞诱导分化为生殖细胞及其在生殖系统方面的应用 2003 年 5 月, Science 的一篇报道提出鼠 ES 细胞体外可分化为卵母细胞, 此后共有三个实验室从小鼠 ES 细胞得到配子样细胞, 体外能产生雄性原始生殖 细胞和单倍体的雄性配子, 在某种程度上表现出具有配子的功能。ES 细胞可以 诱导分化为包括生殖细胞在内的所有细胞类型。ES 细胞在体外一定条件下, 可 以发生减数分裂, 形成精子和卵子, 这为生殖遗传修饰研究提供了一个有用的细 胞培养体系, 对临床生殖医学的发展具有重要作用。 3.5 ES 细胞诱导分化为心肌细胞及其在心血管系统方面的应用 由心肌损伤所致多种心脏疾病, 其共同特点是具有完整收缩功能的心肌细 胞的数量相对或绝对减少, 治疗这些疾病的关键是增加具有完整收缩功能的心 肌细胞的数量, 诱导 ES 细胞分化为心肌细胞,为其提供可能。Norstrom等用拟 胚体( EB )培养方法获得心肌样细胞。Yoon 等发现悬滴培养结合 5-杂氮胞苷处 理可大幅度提高人类 ES 细胞向心肌细胞分化的效率。研究发现, ES 细胞用于 急性心肌梗死、晚期冠心病, 慢性心力衰竭病人, 有改善心肌灌注和/或心肌收 缩的潜能。Cai 等将小鼠 ES 细胞源的心肌细胞直接注射到心梗一周后的大鼠的 心脏瘢痕组织边缘, 4 周后通过超声心动图评估心功能, 发现显著改善了心室功 能, 免疫荧光检测到心肌特异蛋白的表达。ES 细胞向心肌细胞分化的研究将为 冠心病、心脏病、心力衰竭等心脏疾病患者带来希望。 3.6 ES 细胞诱导分化为肝细胞及其在肝脏疾病治疗中的应用 胚胎干细胞在特定培养条件下, 经 specific progeny-FGF, HGF 等细胞因子 作用可定向分化为肝细胞。Hamazaki 等首先采用细胞因子分阶段诱导的方法检 测了拟胚体诱导分化为肝细胞的可能性, 他们将体外培养 5 天的拟胚体接入 I 型 胶原包被的培养板中, 贴壁 3 天后先后添加 FGF1、HGF 和 OSM、Dex、ITS 分 别作为早、中、晚期诱导剂, 连续诱导 9 天后检测到 G6p 和 TAT 两种成熟肝细 胞基因的表达。Ruhnke 等将大鼠 ES 细胞培养在 M atr igel 包被的盖玻片上, 采 用含 FGF4 的培养液进行肝细胞的直接诱导分化, 诱导 21 天后, 免疫组化表明 其表达 CK18、a-lbum in、AFP、AAT 等蛋白。Lavon 等用拟胚体培养方法获 得肝样细胞。将肝特异的白蛋白基因启动子与 eGFP 基因融合, 再将此 ALB- eGFP 融合基因转染人 ES 细胞。EB 培养 20 天后, 检测到 eGFP 阳性细胞, 同时 表达白蛋白。这些实验都显示 ES 细胞可以诱导分化为干细胞, 可用于肝硬化、 肝坏死等肝功能衰竭的细胞移植治疗, 为肝脏疾病患者带来福音。 3.7 ES 细胞诱导分化为软骨细胞成骨细胞及其在骨骼疾病治疗中的应用 临床上常常见到因软骨数量不足或功能缺陷而引起的疾病, 如软骨发育不 全、关节炎类软骨疾病等, 由于没有神经和血管分布, 软骨难以自我修复。ES 细胞在一定条件下, 能诱导分化为软骨细胞, 有希望解决手术难以治愈的疾病。 Hwang 等用 EB 培养方法高效地自人类 ES 细胞获得间充质样细胞。当这些细 胞包埋在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸( RGD )修饰的聚乙二醇水凝胶中, 并结合 TGF-l 处理时, 可观察到新形成的软骨。该软骨中有嗜碱性细胞外基质沉积, 软 骨特异的分子如型胶原、Aggrecan 和连接蛋白( linkprotein)等的表达明显上调。 将 ES 细胞诱导分化为软骨细胞, 可以为严重的软骨疾病患者提供更多的可选择 的治疗方法。K arp 等首次尝试不用 EB 的方法, 将 ES 细胞培养 4 5d 后, 将得 到的单层细胞加入一定浓度 Dex、-磷酸甘油和维生素 C 进行诱导, 35d 后形 成骨结节( 39.1 17.8)个/万个细胞。将 ES 细胞诱导分化为成骨细胞奠定了其 在骨组织修复中的基础。 3.8 ES 细胞诱导分化为内分泌细胞及其在临床中的应用 Vaca 等向小鼠拟胚体培养液中添加胎鼠胰腺培养介质, 其可溶性因子诱导 胚胎干细胞分化成具有 B 细胞标志和功能的细胞, 并恢复糖尿病小鼠血糖。D Amour 模拟体内胰腺发生环境诱导人类 ES 细胞表达内分泌激素, 得到的胰岛素 表达细胞具有与胎儿 B 细胞相似的功能, 在多种内分泌刺激下, 可释放胰岛素 和 C 肽。更多试验在试图将 ES 细胞诱导分化为胰岛 B 细胞, 并移植入糖尿病 患者体内, 如果能成功应用于临床, 可能会使由于胰岛素绝对缺乏的患者得到根 本治愈。徐伟光等将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养, 定向诱导其分化为上皮 样干细胞克隆, 将此生长有上皮样干细胞克隆的人羊膜将小鼠新鲜垂体包裹, 植 入羊膜共培养, 发现有垂体样细胞形成。此实验