耐热保护剂

    猪瘟耐热冻干保护剂活疫苗  王   栋    研究员  中国兽医药品监察所  一  二 . 耐热冻干保护剂作用机理  三 . 耐热保护剂在 配制 过程中注意事项  四 . 耐热保护剂 冻干工艺的优化  五 异常现象的处理   1. 耐热保护剂特性   有免疫活性但无药理活性   能在冻干和保存时维持疫苗的稳定性   在初次干燥时适宜的温度下疫苗不倒塌   低成本易获取   易灭菌   可溶性   外形美观  .  耐热冻干保护剂基质的分类  2. 按相对分子量分类   低分子化合物 提高微生物存活率形成均一悬液。  酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸   中性物质：乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇   碱性物质：精氨酸、组氨酸   高分子化合物 对微生物保护作用，促进升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉  明胶   175、 225、 325 水解明胶：德国、美国   国产明胶（北京、上海）  脱脂奶粉   国产脱脂奶粉   制备酸奶用，无抗生物素   食品用脱脂奶粉    工业用，沉淀剂、絮凝剂   脱脂奶粉、明胶（ 175、 225、 325）在冻干过程中的作用   促进升华   易取得均质产品   加热灭菌   扩大细胞相互间的距离  3.  按保护剂功能和性质分类   （ 1）耐热冻干保护剂  疫苗在冻结和干燥过程中，防止活性组分发生变性。如：海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮（    （ 2）填充剂  防止组分随水蒸气一起升华逸散。如：甘露醇、明胶等  （ 3）抗氧化剂   自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧   阻断冻干样品中氧化链式反应   抑制氧化酶的活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。如硫代硫酸钠  、维生素 E、维生素 C  （ 4）酸碱调整剂  将生物制品 燥。如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠  4. 按物质的种类分类   糖 /多元醇类   聚合物类   表面活性剂类   其它添加剂类   糖 /多元醇类    单糖：葡萄糖、半乳糖    低聚糖：蔗糖、海藻糖    多元醇：甘露醇  、山梨醇  、丙三醇  功能和作用 : 糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置起保护作用   低聚糖：低温保护功能和脱水保护作用   多元醇和糖一样，官能团也是羟基   海藻糖  具有相对较高的玻璃化转变温度。海藻糖 蛋白质 水微冰晶的形成而提高，有效防止了水对玻璃化态的增塑作用  较弱的吸湿性  内部氢键少，有利于蛋白质分子之间形成氢键  化学活性非常低   甘露醇  白色  结晶粉末，无臭、味甜，水中易溶  无菌滤液稳定，不易被氧化  提供支持结构  不与活性组分发生反应   42g，有收缩迹象，与甘露醇联合使用，抗断裂的强度可提高 3 25倍，保证冻干物料的颜色和质地均匀，没有收缩   山梨醇    山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下黏稠状透明液体，有旋光性；略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定。在冷冻干燥配方中，山梨醇用作填充剂    与 碎性   聚合物类  如：聚乙烯毗咯烷酮、葡聚糖、牛血清白蛋白   聚合物类具有以下的性质：    聚合物在冻结过程中优先析出    具有一定的表面活性    在蛋白质分子之间产生位阻    提高溶液黏度    显著提高玻璃化转变温度    抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶    抑制溶液 聚乙烯毗咯烷酮（ 30）    常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂    是很好的保护剂    它在脱水干燥过程中又是很好的填充剂，对生物制品起到很强的支撑作用    在含有缓冲剂的乳酸脱氢酶配方中， 10的 而抑制了系统的 表面活性剂类   降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。   表面活性剂在冻结和脱水过程中降低冰 能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。   表面活性剂可分为离子型和非离子型。凡是溶于水时能电离成离子的，称为离子型表面活性剂，否则，称为非离子型表面活性剂。   在冻干生物制品测定长期储藏中，表面活性剂并没有保护作用。   氨基酸类保护剂   氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是 是由一个氨基（ 一个羧基（ 一个氢原子（ 一个 接在一个 碳原子所组成   常用的氨基酸类的保护剂：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸   甘氨酸是最好的填充剂   氨基酸    甘氨酸、谷氨酸或谷氨酸钠          复合氨基酸（ 199、   甘氨酸  低浓度甘氨酸可通过抑制 10或 100磷酸缓冲盐结晶，所致 可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集  能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏   不同氨基酸对微生物的保护   甘氨酸、谷氨酸钠病毒、细菌、  L精氨酸    其它添加剂类  （ 1）抗氧化剂  （ 2）缓冲剂   （ 3）冻干加速剂   抗氧化剂   自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使  冻干样品物料不被氧化    给出电子或氢原子，阻断冻干样品中的氧化链  式反应    通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化  。如：维生素 E、维生素 C、硫代硫酸钠、硫脲 . 缓冲剂  蛋白质具有两性电解质性质，既能和酸又能和碱作  用。在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的    由于 蛋白质溶液在冻结过程中，溶液的浓度逐渐  升高。在高浓度时可改变溶液的 个单  位导致蛋白质变性，使生物制品失活。   在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。如：  磷酸二氢钾、磷酸氢二钠   冻干加速剂  冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干  循环进行优化，降低生产成本。如：叔丁醇  叔丁醇是一种小分子醇，与水完全互溶，具有低  毒性、高蒸气压。  叔丁醇在药品水溶液中能起到以下作用：   可以降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短干燥时间   溶解难溶于水的药品   使产品具有高的比表面积、好外观，并易于复水   可提高药品溶液和冻干品的稳定性   有一定的抑菌作用  =. 耐热冻干保护剂作用机理  1  冻结过程中低温保护的机理  2  干燥过程中的保护机理  3  储藏过程中的保护机理  1  冻结过程中低温保护的机理  “优先作用”机理认为，蛋白质溶液在达到最大冻  结浓度之前，优先与水作用（优先水合），而保护  剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。这是  由于保护剂的加入，增大了水分子的表面张力，促  使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情  况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的  水分子和相对较少的保护剂分子，从而也就保护了  蛋白质的天然构象    “ 优先作用”机理并不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。因此，必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。限制蛋白质分子扩散的机理认为，许多保护剂都能够提高溶液的黏度，抑制活性分子的扩散      2  干燥过程中的保护机理  （ 1）玻璃态假说  在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且  保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会  形成   玻璃态分为强玻璃、弱玻璃  在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃黏度的增加  比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成  强玻璃的保护效果要好得多。蔗糖和海藻糖就是因为  能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用   （ 2）水替代假说  在蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联接。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性    “ 水替代 ” 假说，当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子空间结构和生物活性所必须的水分子，从而减轻了生物大分子冻干损伤   保护剂对细菌细胞膜的保护   水分子可通过氢键与细胞膜中磷脂的极性端相连，而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端被水分子隔开。冻干保护剂特别是糖类保护剂分子上的羟基具有与膜磷脂上的磷酸集团连接形成氢键的能力，从而阻止和限制细胞膜因脱水而融合，降低相变温度，使脂膜不易向凝胶相转变而保持液晶相，增加膜的流动性   保护剂对蛋白质的保护  由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的连结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性  3  储藏过程中的保护机理  干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间   保护剂指导原则   蛋白质、二糖、氨基酸和缓冲盐水   疫苗块的倒塌温度由赋形剂组成的相对浓度决定   保护剂应在抗原收获或冻干前加入抗原中   它应含有中和羧基活性的物质   电解质成分应含量最少   影响保护剂的因素   种类、浓度、配制方法   灭菌方法   制品表面积  四 . 耐热保护剂在 配制 过程中注意事项  1. 保护剂在配制过程中注意事项   水的标准   称量的准确度和误差   溶解顺序   大分子物质与小分子物质混合   保护剂贮存温度    配制过程中水的要求  配制用水为注射用水或去离子水，水的电导率  1 s/当于 100万 ）。    保护剂的称量  在配制过程中，用量筒准确量取所需注射用水量，  准确称取各保护剂成分逐次加入，一种成分完全  溶解后再加入另一种成分，直至完全加完。（操作  必须由 2个人来完成， 1人称量、 1人复核）。    按照保护剂配方中的先后顺序依次加入溶解。    大分子物质与小分子物质混合时，边摇边加，使二者充分混匀，混合后观察有无沉淀，如有沉淀应停止使用。    耐热保护剂均应按保护剂质量标准要求进行保存，不合理的保存也会影响保护剂的耐热性能。   2. 耐热保护剂的灭菌   大分子部分（高压部分）   高压温度高，时间过长  高压瓶子的大小也会影响保护剂的性能，同是一批  保护剂，使用 1000000保护剂的性能有明显差异，装液体多的瓶子上温时  间较慢，这样在达到某一温度就需要很长时间，导  致保护剂中各成分分解变性   高压后闷锅现象  保护剂在高压后不及时打开高压锅门，致使保  护剂在同一温度停留的时间比较长，影响保护  剂中各成分性能，导致保护剂在冻干过程中起  不到保护作用  解决方法：  按耐热保护剂灭菌的要求时间、温度进行操作  （ 12115 分钟） ,建议使用适当的容器，装量不  宜过大（达到上温快、降温快）。高压后，仪表  降至零，应立即打开高压锅门，不要把保护剂闷  在锅里等冷却后取出，更不要在高压锅里过夜   小分子部分（过滤部分）  不匹配的滤芯也会影响保护剂的质量。不合理滤芯  对耐热保护剂中各物质分子吸附过多，致使保护剂  各成分的最终含量低于保护剂配方的要求含量。影  响耐热保护剂活疫苗的产品质量  解决方法：  要求吸附性小的滤芯，最好是进口的。进口滤芯  （ 可以增加使用次数，除菌效果  又好。国产滤芯吸附性大，而且使用次数少，又  不稳定，影响保护剂的质量  3. 耐热保护剂保存与使用   按耐热保护剂质量标准要求保存。大分子部  分与小分子部分按比例混合后置 2 8 保存，一  般不要超过 10日   每一种保护剂在使用过程中禁止单一加入  (如：将小分子加入抗原后，再加入大分子物质 )，  应将小分子物质与大分子物质按比例混合均匀后  与抗原混合，进行分装  五 . 冻干工艺的优化   冻干过程  1  预  冻  2 一次干燥（冰升华）  3 二次干燥（解吸附作用）     预冻速度：控制在每分钟下降 1 左右   产品降至 40 或冻干机所能降的温度，确保箱内所有疫苗瓶内都降到共熔点 以下   一般以每小时 2 5 为宜   板层温度应控制在 至 3 之间   兽用活疫苗在 或以下温度进行   真空应维持在 100 1203332 16000帕斯卡）   成品看不到冰，产品温度开始向板层温度靠近  3. 二次干燥   以 5 10 /h 为宜，最终制品温度不能超过它的安全温度   每步增加板层温度，每 2小时升温 10 成品温度应该迅速等于板层温度   最终板层温度在 25 35 之间，决定成品的水分含量   病毒类产品要求 25 ，细菌类产品可达 35  在冻干过程中，真空度与产品温度相对应的压  力一致，冰上蒸汽压对应关系和优化冻干过程  见表 1、表 2。    冻干过程优化  温度  （ ）  真空度  （  温度（ ）  真空度  （  温度  （ ）  真空度  （  温度（ ）  真空度  （  0 20 40 60 1 21 41 61 2 22 42 62 3 23 43 63 4 24 44 64 5 25 45 65 6 26 46 66 7 27 47 67 8 28 48 68 9 29 49 69 10 30 50 70 11 31 51 71 12 32 52 72 13 33 53 73 14 34 54 74 15 35 55 75 16 36 56 76 17 37 57 18 38 58 19 39 59  1   冰上蒸汽压表  步骤  方法  举例  固点） 过共晶点测试探头和记录软件测定（当样品从液态过渡到固态时电阻率会增加，样品温度与电阻率曲线交叉点即为共晶点）    10     20   10 =（ ）  备注：预冻 1 20  ）每一步需要的能量：  A： 20 0 =84B： 0 =335晶过程）   C： =42根据冰上蒸汽压表选择温度相对应的压力值：  10   相对应的压力值  10 =         达此压力后搁板会自动停止加热）  5  相对应的压力值  5 =  对于敏感样品，干燥初始的搁板温度应该与安全压力一致   5   + 5 = 备注：冰表面温度与蒸汽温度是一致的  一次干燥时冷阱温度可设定为 ，二次干燥时为了提高捕水力可设定为  对于敏感的冻干样品（病毒 /细菌），在干燥过程中如 于不敏感的样品，微小的变化是允许的  逐步增加搁板温度要求： 冷阱<时，可以快速升高搁板温度  一次干燥温度上升速度为 2 5 /h 如样品温度和搁板温度的差值在 2 左右，可以使用很低的真空度进行二次干燥  最佳的真空度很大程度上受冷阱温度的影响  表 2  冻干过程的优化   包装物指示   管制玻璃瓶和配套胶塞： 45 水浴 24小时瓶是否进水   成品 45 水浴 24小时疫苗是否变形   胶塞应该在 135 干燥 4小时   胶塞灭菌   含饱和水分   冻干品水分由 2升至 5以上   冻干产品质量控制   冻干损失量，效检前后测定   样品瞬间放电实验测定真空   测定产品水分 1   37 耐老化试验是产品工艺中关键一步   冻干产品保存   通常在 2 8 保存   20 或以下胶塞失弹性导致失真空  1 外观差  2 喷瓶  3 制品冷爆脱底  4 制品温度上升  5 剩余水分偏高  6 制品的厚度  六 异常现象的处理    异常现象  （ 1）塌陷   原因  升华过程中，搁板温度过高，系统真空度下降，已干燥部分因处于水蒸气浓度较高的环境中潮解而发生塌陷  停电或因设备故障中断真空和制冷系统运转，也会导致样品塌陷，在升华高峰阶段，设备停机 101. 外观差   措施  在升华阶段，搁板温度应低于制品共熔点 5  10 ，同时保证干燥箱内真空度不高于 0p 在升华过程中突遇停电或其它原因停机，应立  即关上真空蝶阀，使制品处于真空状态，并尽快  修复开机继续升华  （ 2）分层   原因  分装后的样品久置，溶液中的一些不溶物沉淀  析出，导致分层  停机 10 措施  可采用速冻方法，使液态制品在沉淀发生之前  冻结实，保证沉淀物在制品中均匀分布，同时尽  可能提高进箱效率，缩短沉淀时间  提高供电系统的安全性和冻干设备的可靠性及  设备操作人员素质，是解决问题的唯一途径  （ 3）起壳   原因：产品进箱温度过高、分层，预冻过程中样  品冻结不坚实所致   措施：产品进箱温度控制在 0 5 为宜。延长  预冻时间，确保样品冻实  （ 4）裂纹   原因：制品中干物质含量过高或粘稠度不够   措施：减少干物质含量，正常含量应控制在 2025%左右  （ 5）萎缩   原因  药品内含有残留水分；样品浓度不宜太高或太低；  升华时温度高于共熔点或解析温度升高过快，真空  密封不良；胶塞水分含量偏高，未作干烤处理，都  能导致冻干品萎缩   措施  升华过程中严格控制样品温度低于共熔点，解析时  搁板升温速度不宜太快，一般控制在 5/h 左右，  其产品温度不能超过崩解温度；产品出箱后严格检  验真空度，确保良好的密封性；使用干烤过的胶塞  (6)粗结晶   原因  粗结晶是在预冻阶段形成的，与后期干燥无关。  入箱时板层温度和冻干过程中的降温速度是导致  样品产生粗结晶的主要因素   措施  样品入箱时，板层温度控制在 0 10 ，同时加快入  箱速度；入箱后，立即将板层温度 降至样品共晶点温  度以下 10 15 ，保证冻结过程一次性完成，即快速  预冻  2. 喷瓶   原因  冻结不实， 升华干燥时升温过快，局部过热，部分制品溶化成液体，在高真空度条件下，少量液体从已干燥固体表面穿过孔隙喷出而形成    分装样品时，液体流速较快，形成一定量的气泡存在瓶内液体中   措施    严格控制预冻温度在共熔点以下 10 15 ，并保持 2小时以上，使药品冻实后再升温；升华干燥时的供热量要控制好，适当放慢升温速度，且控制温度不超过共熔点   当液体中有气泡时，将液体放置一定时间让气泡充分逸出   放气速度不宜太快，否则会使箱内真空度突然大幅度变化，会形成一股湍流冲入容器内，使制品变成絮状或粉末   3. 制品冷爆脱底   原因   制品在没有完全冻结实的情况下，系统就开始对  箱体抽真空，当压力达到某一数值时，没有冻结好  的部分就开始蒸发沸腾，产生放热现象，而其本身  温度急剧下降，到达共