荧光探针的光谱性质

绪论 1.1 前言 A1-40 是阿尔茨海默病的主要标志物之一，且 A 单体可以自组装成高度有序的结构，包括 二聚体、三聚体、四聚体，或者更大的结构，直至形成纤维。研究表明，A 寡聚体具有更强 的神经毒性，二聚体和三聚体会破坏神经纤维的弹性，而三聚体和四聚体的毒性是 A 纤维的 二倍。总之，研究表明 A 早期积聚体可能是疾病诊断的依据之一1-6。因此能够及时、简便、 有效的检测出 A 的这种异常的现象，则对于预防和治疗 AD 既有重要的理论意义又有实际意 义。 为了检测 A 的寡聚体，已经发展了抗体和单链抗体技术7-8，已报道这些抗体和特征分子形 成特异性识别作用9。荧光分析法灵敏度高，使用方法简便，而且样品处理简单，具有在溶液 中可无损、实时连续检测等优点，因此得到广泛应用16-21。本文基于 A 抗体的研究基础， 结合荧光技术，以 A 的 DNA 适配体为识别基团，结合荧光分析方法特点，制备荧光探针， 识别 A 早期积聚体。而探针 T-SO508 序列(5to3)为 GCCTGTGGTGTTGGGGCG GGTGCG。本文针对探针 T-SO508 对 A 作用及检测进行实验。 我们的实验证明，所制备的荧光探针对 A1-40 具有一定的识别作用，但是由于用于检测的 A1-40 没有以分子量将其区分，所以识别作用不是特别稳定，下一步准备看能否将 A1-40 分开，特征检测二聚体和三聚体。 2 实验部分 2.1 试剂和药品 T-SO508（生物工程上海股份有限公司，1 mg，AR）修饰 5JOE,3TAMRA ，JOE：2，7- 二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE 更被广泛使用。JOE 荧光 产量高，pH 敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE 也适合于 Argon-ion Laser 激发光源， Abs/Em=520/548（pH=9.0） 。常用于 DNA 自动测序，标记 d/ddATP，也经常被用于进行 电泳检测与 PCR 产物定量。TAMRA 是用于标记蛋白的，全名为羧基四甲基罗丹明，是一种罗 丹明类荧光素衍生物，其中 6-TAMRA 适用于 Argon-ion Laser 激发光源，常用于荧光标记试 剂盒中，且 Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0） 。探针浓度的配置：加入 500 L（TE 缓冲溶液， PH=8.0）浓度为 9 M，作为工作液 1；TE 缓冲溶液的配制：称取 Tris 碱 6.06 g，加超纯水 40 ml 溶解，滴加浓 Hcl 约 2.1 ml，调制 PH=8.0，定容 50 ml 成 1 M Tris-Hcl；称取 9.306 g EDTA-Na22H2O，加超纯水 35ml，剧烈搅拌，用约 1 g NaOH 颗粒调至 PH=8.0 定容至 50 ml 成 0.5 MEDTA；1M Tris-Hcl 1ml,0.2 ml 的 0.5 M EDTA 混合并加超纯水定容至 100 ml。三种不同纯度的 A1-40（上海强耀生物科技有限公司， 1.0 mg，AR） ，分别为 A1-40 纯度 90%，A1-40 纯度 95.65%，A1-40 蛋白纯度 98%，,用类似的方法将其配制浓度并作 为工作液 2：若加入溶剂二甲基亚砜 0.5 mL 则得到 462 M 的 A1-40；若加入溶剂二甲基 亚砜 1 mL 则得到 231 M 的 A1-40。 2.2 仪器设备 Agilent Technologies Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer（安捷伦科技有限公 司） ，用于荧光光谱、荧光强度的测定；荧光比色皿，移液枪，5 L 的移液针，1 L 的移液针， 用于液体的移取，恒温水浴锅，试管加热器等。 2.3 实验操作方法 （1）实验分类 将不同含量的 A 分为三组，第 1 组为 A 纯度为 90%，向其加入 1 mL 二甲基亚砜配置成 浓度为 231 M 作为工作液 2，T-SO 508 探针中加入 500 L TE(pH=8)配置成浓度为 9 M 作为工作液 1。荧光测定仪在使用前预热 15 min，比色皿要用 TE 缓冲溶液润洗，操作期间要 保持所用仪器的清洁。每次加入试剂之前要用擦镜纸擦拭移液枪、微量进样器等，并多次更换 移液头。 第 2 组为 A 纯度为 95.65%加入 0.5mL 二甲基亚砜配置成浓度为 462 M 的 A 作为工作 液 2，T-SO 508 探针仍使用第 1 组中配置好的浓度。仪器及实际操作同上，但唯一不同的是 本次实验要控制温度为 37，打开白色暗箱使其停留在 stand by 状态，同时打开恒温水浴锅， 此时要注意检查循环水是否正常流通，待温度达到 37时才可以开始扫描。 （水浴锅上显示的 温度不准，以界面上温度控制系统显示的温度为准） ，每次加入试剂后待温度稳定后再扫描。 第 3 组为 A 纯度为 98%，加入 0.5 mL 二甲基亚砜配置成浓度为 462 M 的 A 作为工作 液 2；T-SO 508 仍用第 1 组配置好的浓度；仪器与试剂操作同第一组。此次实验同样控制温 度，但不用恒温水浴锅，采用试管加热器。首先将试管加热器设置为 37，之后在每次加入工 作液后将比色皿放入试管加热器中大约加热 5 min 即可达到 37，取出并快速放入荧光检测 仪中进行扫描。 （2）荧光探针的测定 荧光光谱的测定，取 2.0 ml TE 缓冲溶液置于已洗涤干净并用其溶液润洗过的比色皿中，作为 参比，设定激发波长 526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为 527-650 nm，扫描 出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为 10 nm，发射狭缝宽度为 5 nm。再向比色皿中加入 5 L 工作液 1，设定激发波长 526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为 527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线。标准加入法不断的向比色皿中加入工作液 1 直到它的强度不在 随浓度的变化而变化。此时的探针达到最大强度，记下此时的荧光强度作为 F0，并且每次扫描 都记录相应的荧光强度。 （3）检测 A1-40 当探针 T-SO508 的荧光强度最强时，向其比色皿中逐次加入 A1-40 即工作液 2，充分搅拌均 匀后，设定激发波长 526 nm，响应时间为自动，中速扫描，测定范围为 527-650 nm，以扫 描出发射线；再设定发射波长为 553nm，响应时间自动，中速扫描，测量范围为 450-550 nm，以扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为 10 nm，发射的狭缝宽度为 5 nm。此外，再以激 发波长为 553 nm，测量范围为 554-650 nm 扫描出发射线。记录每次扫描时的波长与其对应 的荧光强度，并以 F1、F2、F3 等等标注。 3 结果与讨论 3.1 T-SO508 的荧光光谱性质 在 2 mLTE 缓冲溶液中加入浓度为 9 M 探针 T-SO508，设定激发波长 526 nm，中速扫描， 响应时间为自动，测定范围为 527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中 速扫描，响应时间为自动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线。随着探针的不断加入荧 光强度不断增强直到加到 23 L，此时荧光信号为 71，探针浓度为 0.207 M。每次扫描记录 荧光强度，不同浓度下的荧光强度如下图所示： 图 1 不同浓度荧光探针的荧光强度随探针的浓度的变化曲线，其中探针 T-SO508 的浓度分别 为(0,22.5,27 ,45,54,58.5,63,67.5,72,76.5,81)10-9 mol/L 由图可见，随着荧光探针的加入，荧光强度不断增加，其浓度和荧光强度的线性方程为 y=3.11x+6.51，相关系数为 0.998，样本容量 11。 3.2 T-SO508 对 A1-40 的检测作用 用 A1-40 纯度90%配置浓度为 231 M 工作液 2，如图 2 所示；在浓度为 0.207 M 的探 针中开始加入 A，共加入 23 L。设定激发波长 526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定 范围为 527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中速扫描，响应时间为自 动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线。图中右下侧为设定激发波长 553 nm，中速扫 描，响应时间为自动，测定范围为 553-650 nm，扫描出发射线，也就是 F1F2F3 等等这些荧 光强度。 图 2 A1-40（上海强耀生物科技有限公司，1.0mg,纯度90%）加入的 A 浓度分别为 （0,5.78,11.55,17.33,18.48,19.64,20.71,21.95,23.1,24.26,25.41,26.57）10-7 mol/L 由图可见，随着 A1-40 的加入，荧光强度不断降低，以未加入 A1-40 时荧光探针的的荧光 强度为 F0，加入 A1-40 后的荧光强度为 F，以 F/F0 对 A1-40 的浓度作图，由插图可见， 随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0 对 A1-40 的浓度的线性方程为 y=- 0.0061x+1.2226，相关系数为 0.9097，样本容量 9。 3.3 温度对荧光强度的影响 （1）用 A1-40 纯度 95.65%配置浓度为 462 M 作工作液 2，如图 3 所示；采用温控系统控 制温度在 37 （实验室温控系统出错，可能比实际温度高） 。设定激发波长 526 nm，中速扫 描，响应时间为自动，测定范围为 527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线。探针 T-SO508 直到加到 26 L 开始加入蛋白共加入 104 L，每次扫面记录荧光强度。 图 3 探针强度随 A1-40 浓度的变化（A1-40，上海强耀生物科技有限公司,1 mg，纯度 95.65%）A1-40 的浓度 1-10 分别 （1.16,2.31,3.47,4.62,5.78,6.01,6.24,6.7,7.86,10.16,12.48,14.79,19.40,21.71,24.02)mol/L 由图可见，随着 A1-40 的加入，荧光强度不断增强，以未加入 A1-40 时荧光探针的的荧光 强度为 F0，加入 A1-40 后的荧光强度为 F，以 F/F0 对 A1-40 的浓度作图，由插图可见， 随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0 对 A1-40 的浓度的线性方程为 y=6.319x+0.9898，相关系数为 0.9868，样本容量 11。 （2） A1-40 纯度 98 %配置浓度为 462 M 作工作液 2，如图 4 所示；控制温度 37 （在 试管加热器中设置 37 ，每次加入溶液后加热 5 min） ；设定激发波长 526 nm，中速扫描， 响应时间为自动，测定范围为 527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为 553 nm，中 速扫描，响应时间为自动，测量范围为 450-550 nm，扫描出激发线。探针加入 45 L 时加入 A，共加入 105 L，右侧图为设定激发波长 553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范 围为 553-650 nm，扫描出发射线。 图 4 左图为探针荧光强度，浓度分别 （22.5,45,67.5,90,112.5,135,139.5,148.5,157.5,180,202.5）10-9 mol/L；右上方为探针荧 光强度随体积变化曲线，成上升趋势。右图为加入 A 以 553nm 为激发波的荧光强度，而加 入的 A 浓度分别为（2.31, 4.62, 6.93, 8.09, 10.40, 12.71, 15.02, 17.33, 21.95, 24.26） mol/L；右上方为 A 荧光强度随体积的变化曲线，成上升趋势。 由图 4-1 可见，荧光强度随着荧光探针的增加而增加，由图 4-2 可见，随着 A1-40 的浓度的 增加，发射强度呈上升趋势。随着 A1-40 的加入，荧光强度不断增强，以未加入 A1-40 时 荧光探针的的荧光强度为 F0，加入 A1-40 后的荧光强度为 F，F/F0 对 A1-40 的浓度的线性 方程为 y=（3.2710-4）x+1.01，相关系数为 0.9119，样本容量 11。 3.4 结论 对比以上三组实验，可以发现荧光强度相差甚大。3 组实验的关键不同点是温度，第 1 组中没 有控制温度，是在室温下操作的，室温大约 20，而其荧光强度最大不到 80，第 2 组与第 3 组就截然不同，第 3 组的荧光强度达到 500 以上，而第 2 组的荧光强度达到 800 以上。这种 巨大的差距来源于温度，第 3 组采用的试管加热器控制温度，相对温度控制较好；第 2 组采用 恒温水浴锅控制温度，本实验所用恒温水浴锅控温不太准确，系统界面温控显示在 37时，水 浴锅已经达到 49.6以上，可能使试剂的温度较高。因此可以得出探针 T-SO 508 的荧光强度 与温度有很大关系，之后随着 A 的加入后，荧光强度并不明显变化。从而可以得出探针 T- SO508 的荧光强度与温度有很大关系，但是与 A 蛋白的作用并不太明显。由三种不同的拟合 曲线 F 与 V 的关系可