药物质量控制1

1.(原始的原始的)色谱图为什么要经过数字化才能成为色谱指纹图谱？色谱指纹图谱数字化包括哪色谱图为什么要经过数字化才能成为色谱指纹图谱？色谱指纹图谱数字化包括哪 些内容？些内容？ 一、基本概念一、基本概念 1、指纹图谱、指纹图谱(Fingerprint) 指纹图谱是指某种或某产地样品中所共有的、具有特异性的某类或数类成 分的色谱或光谱的图谱。其特点在于通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品 的真伪或产地。通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样 品的质量，确保样品的相对稳定。 2、数字化色谱指纹图谱、数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint) 数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint)又称相对保留值 指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样 品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将 色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定 位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图 转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进 行研究。 二、指纹图谱的发展、属性和作用二、指纹图谱的发展、属性和作用 指纹图谱的产生与发展1，指纹图谱技术应用于植物药质盆控制可以追溯 到上世纪年代初，随着色谱技术尤其是薄层技术的发展，人们大量采用薄层色 谱的方法将植物药中化学成分展开于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板 上斑点的位值、斑点大小、斑点颜色、斑点数目的多少来进行定性鉴别，这种 薄层鉴别方法己具备了指纹图谱特征，并被广泛应用。80 年代及 90 年代，由 于薄层扫描仪的出现使得薄层鉴别方法得到进一步发展，日本和我国部分学者 用当时的薄层扫描仪得到复方成药扫描图谱作为色谱指纹图尝试应用于药材及 成药分析。现代新型的薄层扫配备有自动点样系统、成像系统、数据处理系统， 可将薄层板色谱结果转变成类于液相的色谱图，薄层扫描色谱图与薄层色谱结 果结合，相得益彰，使得薄层扫描术成为指纹图谱研究的主要方法之一。与此 同时，高效液相技术得到了长足发展，随着植物药中化学成分的分离鉴定、活 性成分的不断阐明，人们更多应用高效液相法行定性、定量分析。西方国家如 德国、美国、加拿大等普遍采用高效液相色谱法对物药中己知及未知组分进行 控制，并形成相应的规范。新近几年国内有关学术期刊刊登了一些应用高效液 相色谱法研究指纹图谱的论文。 何谓中药指纹图谱，谢培山教授将其定义为它是一种综合的，可量化的鉴 别手段，现阶段，通过色谱指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优略、 考察稳定性和致性，是一种复合中药特色的质量控制模式之一2。整体性和和 模糊性是它的基属性。中药新药等的质量控制水平，以中药注射剂为重点，逐 步扩大指纹图谱等多方法在中药质量控制中的应用.国家药监局要求中药注射剂 在固定中药材品种、产和采收期的前提下，制定中药材、有效部位或中间体、 注射剂的指纹图谱。指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。现 在不仅国内，而且国际都取得了共识，即中药不是单一组分在起作用，而是药 物的整体起作用。对于色谱纹图谱中的各色谱峰，并不要求对每个组分的化学 结构都清楚，也不需要对呈现在谱中的每个组分都清楚地定量，只需不同批号 的同一种药品的指纹图谱保持基本一。即指纹图谱分析强调准确的辨认，而不 是精密的计算，比较图谱强调的是相似，不是相同。中药指纹图谱反映了该中 药的化学组成及其含量分布状况，可实现对中的多组分和多指标分析，对鉴别 药材的真伪优劣及其稳定性均具有非常重要的参考值。中药指纹图谱还可以解 决标准品缺乏的难题。即使在没有标准品的情况下，仍可选择以道地药材为标 准对各中药样品进行鉴别和进行质量控制63。 三、指纹图谱的应用概况三、指纹图谱的应用概况 近几年，中药指纹图谱的研究逐渐深入，设计的方法种类繁多，包括: (l)、色谱法：传统的薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和高效毛细管 电泳法等； (2)、光谱法：紫光谱法和红外光谱法等； (3)、牌谱法：质谱法和核磁共振法等； (4)、其他方法：如 x 射线射法，分子生物学方法等.其中色谱学方法是主流 方法，尤其是 TLC、HPLC 和 GC 已经成为大家所公认的三种常规的分析手段. 四、色谱图经过数字化才能成为色谱指纹图谱的原因四、色谱图经过数字化才能成为色谱指纹图谱的原因 数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint)又称相对保留值 指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样 品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将 色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定 位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图 转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进 行研究。 如果以样品的色谱图外形直接作比较，将存在许多实验过程中的系统误差 和鉴定者的主观误差，例如流速的波动、进样量的差异、固定相的流失、校填 充情况的细微变化、流动相的微小改变等操作引起的误差。当用每个色谱峰相 对保留值及其相对应的面积归一化值作比较时，减少了保留值的漂移的影响， 保证了色谱峰的正确定位，增强了鉴定的客观性、科学性和公正性。通过使用 这些量化指标，将使色谱指纹图谱技术在中药质控和质标中发挥更大的作用。 五、色谱指纹图谱数字化的内容五、色谱指纹图谱数字化的内容 1、相对保留值、相对保留值 的计算的计算 在实验色谱条件下，色谱峰较多且相当密集，难以插入一个合适的参照物。 选择一个出峰时间较居中、各样品中均存在的组分作内参照峰(可采用叠加法等 方法予以标定)求出样品中所有峰的相对保留值 。 = tRi/tRs tRi各组分的出峰时间, tRs内参照峰的出峰时间 2、 值窗口的设定值窗口的设定 由于保留时间受各种实验因素的影响，每一次实验数据不可能完全一致， 故对每个峰值的 值设定窗口如为 1或 2等，即通过大量的实验数据计算 每个峰值的 值，取可信限在l或2的范围内。 3、指纹图谱的建立、指纹图谱的建立 按样品各色谱峰 值的大小次序排序，在每个 项下标出该组分的相对 面积值(RA)或归一化面积值(Ar)即组成了样品的 HPLCFPS。 归一化面积值(Ar) s i A A Ai某样品中某个色谱峰的峰面积， As某样品中参照峰的峰面积 相对面积值(RA)100% A Ai Ai某样品某个色谱峰的峰面积， A标准样品的总峰面积值峰 4、 共有峰共有峰 两个样品中具有相同 值的色谱峰为共有峰。若为多个样品所共有，则 称为多个样品的共有峰。 5、 重叠率重叠率 重叠率=100% 待鉴药材峰数标准药材峰数 共有峰 2 由于共有峰意味着在两样品中的色谱峰位是相同的，它们在总出峰数中所 占的比率反映了两者的相似程度，即重叠的百分率。 6、 n 强峰强峰 在众多的色谱峰中按其面积值的大小，选择列前的 n 个色谱峰为 n 强峰。 一般以总峰数的 1513 为宜。 7、 指纹图谱之间相似度的评价。指纹图谱之间相似度的评价。 参考文献 1谢培山，中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用J.中国中药杂志， 2001，26(10):653. 2谢培山.中药色谱指纹图谱M.北京:人民卫生出版社，2005. 3李兰、王学军、张立国.色谱指纹图谱及其在中药质量控制中的应用z.天津药学， 2002，14(6):6. 2.阐述阐述 SPME 的基本理论。的基本理论。 一、基本概念一、基本概念 1、固相微萃取、固相微萃取( ( SolidSolid PhasePhase MicroMicroextractionextraction，SPME)SPME) 固相微萃取技术 ( Solid Phase Microextraction，SPME)集取样、萃取 及富集于一体，操作简便，而且具有萃取速度快、操作成本低以及便于实现自 动化1 3。被广泛应用于药物分析、烟草分析及食品风味的分析等4。SPME 具有分析样品使用量少，对被测样品选择性高，溶质更易洗脱，几乎无空白值 和重现性好等特点。此技术利用被测样品对活性固体表面 ( 溶融石英纤维表面 的涂层) 有一定的吸附 ( 吸收) 亲和力达到被分离、富集的目的。目前已商品 化的涂层有聚二甲基硅氧烷 ( PDMS) 、聚丙烯酸酯 ( PA) 、聚二甲基硅氧烷/ 羧乙基 ( PDMS /CAR) 、二乙烯基/羧乙基( DVB /CAR ) 聚 二 甲 基 硅 氧 烷/二 乙 烯 基( PDMS / DVB) 等5。固相微萃取(Solid Phase Micro- extraction, SPME)在 1990 年出现，并且对其性能优化，实现了自动化。这种 无溶剂的样品前处理技术能将采样、收集、富集于一体，由于固相微萃取操作 简便，实验时间短，因此，在环境分析、食品安全、医学药学等方面有广泛的 应用。固相微萃取的过程是先采用一根涂渍多聚物固定相的熔融石英纤维从液/ 气态基质中萃取待测物，一定时间后，将富集了待测物的纤维直接转移到色谱 仪中，通过一定的方式解吸，然后进行分离分析。然而，SPDE 仍有其自身难以 克服的缺点:(l)纤维头价格昂贵、易碎、使用寿命短;(2)萃取头上的聚合物在 使用过程中会有部分丢失，因而引起目标物峰高的改变，影响分析结果的精密 度;(3)SPME 和 GC 联用时，分析某些物质(如含氯农药，高分子量化合物象腐殖 酸、蛋白质)纤维具有记忆效应，即使是提高解吸温度也很难消除这种现象。同 时因为固相微萃取不是完全萃取，因此在定量上必须精确，否则难以达到应有 的准确度。 二、二、SPMESPME 装置装置 固相微萃取装置由萃取头和手柄两部分组成 ， 如图 1 所示 图 1 固相微萃取装置 萃取头是 SPME 装置的核心， 其涂层遵循“相似相溶”的原则， 涂层的 极性与厚度必须与分析物的性质相匹配。理想的萃取头涂层应能满足: 对于分 析物要有较强的萃取能力; 能在较短时间内达到吸附平衡; 热解吸时分析物能 迅速地从萃取头上解吸;所选萃取头必须具有良好的热稳定性。 手柄主要是在采样时将萃取头推出， 使萃取头直接暴露于环境空气中进行 采样， 无需动力。采样结束后， 旋进萃取头即可。分析时， 该装置直接插入 色谱仪的进样口， 用手柄推出萃取头， 吸附在萃取头上的有机物就会在进样口进行热 解吸。 三、三、SPME 的采样方式的采样方式 SPME 技术集样品预处理和进样于一身， 按照采样方式可分为三种。 1、 直接固相微萃取法 直接萃取法是将纤维直接插入样品中， 待测物从样品基体直接迁移到萃取 纤维上， 达到分配平衡后即可取出进行色谱分析。该方式适用于分析气体样品 和洁净水样中的有机化合物， 缺点是纤维的使用寿命比较短。 2、顶空固相微萃取法 顶空萃取是将纤维暴露于密封样品上方的气相中， 萃取挥发到固体或液体 样品顶空上的待测物。该方法由于是在液面上进行顶空萃取， 可避免基体干扰 和提高分析度。相对于直接萃取法， 顶空法对扩散系数大的挥发性物质， 更 具有优势。 3、膜保护萃取法 纤维通过一个选择性的膜与样品隔离， 待测物通过选择性膜吸附到纤维上， 而样品中高分子量的化合物不能通过， 从而排除基体干扰。该法可用于难挥 发性化合物的分析。由于待测物先要扩散穿过膜， 才能吸附到涂层上， 所以 萃取时间较长。 四、四、 SPMESPME 定量分析依据定量分析依据 固相微萃取是基于待分析物在萃取介质（涂层）和样品基质间的分配系数。 在使用某种液体涂层进行萃取时，在萃取平衡状态下和萃取前的待分析物的量 应保持不变，有下列关系： (1) LLSS VcVcVc 00 式中： 样品中待分析物的初始浓度； 0 c 平衡时样品中待分析物的浓度； S c 平衡时涂层中待分析物的浓度； L c Vs样品的体积； VL涂层的体积。 设待分析物在涂层和样品基质间的分配系数为 KfS，待分析物在涂层中 的吸附量为 n,则 (2) SLfS ccK/ (3) LL Vcn 将上边(2)、(3)代入式(1),整理得： (4) SLfS SLfS VVK VcVK n 0 (4)式表明，涂层的待分析物吸附量与样品中该物质的初始浓度呈线性关 系，即待分析物在样品中的初始浓度越高，当达到吸附平衡时，涂层中被吸 附物的量越大。 因固相微萃取中使用的涂层物质对于大多数有机化合物都具有较强的 亲和力，故 KfS值对目标分析物来说特别大。这意味着固相微萃取具有很强 的浓缩作用，因而对待分析物的检测具有较高的灵敏度。 在式(4) 中，若 Vs 很大(即 Vs KfsVL)，则涂层萃取被分析物的量与样 品的体积无关： (5) 0 cVKn LfS 根据这一理论模型， 对于固定的萃取体系中的待测物而言， Kfs、 VL和 Vs 是固定不变的。因此， 当萃取体系达到平衡时， 萃取涂层上吸附待测物 的含量与待测物在样品中的初始浓度成正比。 五、五、SPME 的应用的应用 1、固相微萃取技术在食品痕量残留和污染分析中的应用、固相微萃取技术在食品痕量残留和污染分析中的应用 食品痕量残留和污染分析中, 样品的前处理极为重要,也是其难点所在。由 于食品和农产品样品的多样性和复杂性, 目前还没有一种前处理技术能够适合 所有情况下的所有样品。朱捷等 6以顶空 SPME 作为前处理手段, 采用气相色 谱 质谱(GC- M S)联用方法测定了牛奶样品中 23 种有机氯农药和 8 种拟除虫 菊酯类农药。B lasco 等 7用 SPME 提取樱桃、 柠檬、 桃和橘子中的杀菌剂, 比较了动态和静态模式的解吸效果,同时优化了固相微萃取-液相色谱 ( SPME- LC)过程中的解吸作用,发现静态解吸作用的提取率和回收率较高;并采用高效液 相色谱 质谱(HPLC-MS)测定了 5 种杀菌剂,证明该法可用于测定水果中的极性 农药残留。Hernndez Borges 等 8报道了 SPME 和不同的在线预浓缩-超敏感毛 细管电泳-紫外检测器联用,定量分析苹果和橙汁中的 5 种农药残留, 通过对 4 种不同在线预浓缩方法的比较,发现反极性去基质富集的灵敏度、 有效性和重 复性最好,检出限可达 31 g /L , 低于欧盟的最大残留量 (MRLs)的要求。Ishizaki 等 9应用管内 SPME 与高效液相色谱荧光检测器联用,在线测定了茶叶和干食品 中 15 种多环芳烃残留。结果表明,使用管内 SPME 方法的灵敏度比直接进样方 法高 18 47 倍。该方法的线性范围为 005 20 ng /mL , 检出限为 032 463 pg /mL , 回收率大于 70 %, RSD (n = 5)为 51 % 76 %。Rodri gues 等 10以聚二 甲基硅氧烷- 二乙烯基苯纤维萃取头作为萃取材料, 用顶空 SPME 与 GC- MS 联用, 测定了牛奶中 10 种有机磷农药残留,检出限为 216 g /L。 各国对食品中有毒有害物质所规定的允许残留量越来越低,这对样品前处理 也提出了更高的要求。由于食品和农产品样品的多样性和复杂性, 目前还没有 一种前处理技术可以一次性地同时提取净化食品中的所有有毒有害物质,因此发 展高选择、 高效的吸附剂,拓宽样品的应用范围是固相萃取技术研究的重要方 向。预计未来食品分析将会由单一种类多残留分析向多品种多残留分析发展, 而有毒有害物质的代谢物和降解物的残留分析也将成为食品分析方法的发展方 向之一。 2、固相微萃取在水中有机污染物测定中的应用、固相微萃取在水中有机污染物测定中的应用 苯系物是 SPME 方法应用最早的典型非挥发性有机物， 经常被用于研究 SPME 的萃取理论和动力学。苯系物的工业污染源主要是石油、化工、炼 焦 生 产 的 废 水。分 析 苯 及 其 同 系 物( BTEX) 时应用较多的为 PDMS 萃取头， 如赵国有等11应用顶空固相微萃取技术对水中的苯系物( 苯、 甲 苯、 乙苯、 对二甲苯、 间二甲苯、 邻二甲苯) 进行了分析检测。王若苹等 12 建立固相微萃取 毛细管气相色谱法快速分析水中苯系物， 富集效率 高达 73 106 倍， 全过程只需 15min， 检出限可达 1. 0 2. 0g /L，可 以 满 足 环 境 水 样 监 测 要 求。酚类化合物是属于半挥发性有机物， 也 是许多其它污染物的分解代谢产物。这类化合物极性较强， 难以从水中萃取， 目前对这类化合物的分析主要是采用液 液萃取法和固相萃取， 用 SPME 方法分析酚类化合物主要集中于酚、 氯酚、 双酚 A 等的研究， 由于酚是极 性化合物， PA 萃取头广泛用于此类分析物。邰昌松等13采用顶空固相微萃 取 气相色谱法测定水中五氯酚， 结果显示， 该方法简便、 灵敏、 稳定， 且无溶剂污染， 是测定水中五氯酚理想的方法。 3、 在其他有机污染物中的应用在其他有机污染物中的应用 除以上几类分析外， 还有很多学者对多种不同种类的有机污染物及其他的 有机污染物进行了分析， 如烷烃、 乙腈、 丙烯腈、 卤代烃、 有机磷农药等。 杜欢永等14对空气中的丙酮、 醋酸乙烯酯、正己烷、 醋酸乙酯、 苯、 庚 烷、 四氯乙烯、 醋酸丁酯、乙苯、 二甲苯、 醋酸异戊酯、 苯乙烯、 异丙 苯进行了分析。穆肃15用固相微萃取 毛细管气相色谱分析水中甲醇、 丙 酮、 异丙醇、 乙醇、 乙腈、 丙烯腈。Sun 等用活性炭萃取头对水中卤代烃 进行了分析， 田明16采用固相微萃取 气相色谱法对水中 5 种有机磷农 药进行了分析。 参考文献: 1 刘军锋，昝俊峰，陈家春，刘焱文 固相微萃取技术在中医药挥发性成分分析中 的应用 J 湖北中医学院学报，2006，8 ( 3) : 29- 31 2 连宗衍，杨丰庆，李绍平 顶空固相微萃取 气相色谱质谱法定性定量分析广 霍香中的挥发性成分 J 分析化学，2009，37 ( 2) : 283- 287 3 Pawliszyn J，Arthur C L Solid phase microextraction with thermaldesorption using fused silica fused silica optical fibersJ Analytical Chemistry，1990，62: 2145- 2146 4 Luis F C G，Jorge A P，Louis S S，et al A review of volatile analytical methods for determing the botanical origin of honeyJ Food Chemistry，2007，103: 1032- 1043 5 朱军莉，汪海峰 不同萃取头固相微萃取提取分析饲料香味剂致香成分 J 饲料工业，2009，30 ( 16) : 42- 44. 6 Zhu J , Yang X, Feng J F, et a. l Chinese Journal of Food Hygiene (朱捷, 杨欣, 封锦芳, 等. 中国食品卫生杂志 ),2007 , 19( 4): 289 7 B l asco C, Font G, Mae s J , et a. l Anal Chem, 2003 , 75:3606 8 Hern ndezBor ges J , Cifuentes A, Garc a Montelongo F J ,et a. l Electrophoresis , 2005 , 26: 980 9 Ish i zaki A, Sa ito K, H ani oka N, et a. l J Chromatogra,2010 , 1217 : 5555 10 Rodr i gue s F M, Mesquita P R R, de O l i veira L S , et a. l Micro-chem J , 2011 , 98: 56 11 赵国有， 张榕等 顶空固相微萃取法检测水中的苯系物J 中国卫生检验， 2000， 10( 2) : 142 145 12 王若苹， 杨红斌 固相微萃取 毛细管气相色谱法快速分析水中苯系物 J 现代科学仪器， 2002，( 3 ) :45 47 13邰昌松， 赵萍， 徐小作等 水中五氯酚的顶空固相微萃取 气 相 色 谱 测 定 法J 环 境 与 健 康， 2004，21( 2) : 107 109 14 Garroque V，Desauziers V，Mocho P Ana1 Bioana1J Chem， 2006，386: 1457 15 穆肃 固相微萃取 毛细管气相色谱法测定水中有机污染物J 环境科学 与技术， 2006， 29( 3) : 48 49 16 田明 固相微萃取 气相色谱法测定水中的 5 种有机磷农药J 云南环境 科学， 2001， 20( 4) : 60 62 3.就分子印迹聚合物整体柱的制备及其应用举就分子印迹聚合物整体柱的制备及其应用举 1-2 个例子进行阐述。个例子进行阐述。 一、基本概念一、基本概念 1、分子印迹技术、分子印迹技术 分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology，MIT)又称分子印记技术、 分子烙印技术。分子印迹技术是将印迹分子(模板分子)、功能单体、交联剂、引 发剂、溶剂 (致孔剂)按一定的比例混合、静置, 使功能单体以共价键或非共价 键与印迹分子充分结合后, 采用紫外光引发或热引发聚合反应, 再将模板分子洗 脱, 以制备可识别模板分子的高分子聚合物, 即分子印迹聚合物 ( Molecular Imprinting Polymers , 简称 M I P)的一种技术。该技术可广泛用于色谱分离分析、 制备催化剂、传感器、固相萃取等。 2 、整体柱技术、整体柱技术 整体柱( monolithic column) , 又称为棒状柱( rodcolumn)、 连续床( continuous bed)、 无柱塞柱( fritless column) ,它是由单体、 引发剂和致孔剂等 混合物通过原位聚合方法制备成的一个棒状整体。整体柱与常规填充柱相比具 有更好的多孔性和渗透性, 具有灌注色谱的特点,即色谱柱中既有流动相的流通 孔(接近 1 m)又有便于溶质进行传质的中孔( 几十个纳米) ,而且色谱柱的稳定性 很好。 3 分子印迹整体柱分子印迹整体柱 由于分子印迹技术的高选择性和整体材料的诸多优点,二者结合起来是一个 必然的发展趋势,即分子印迹整体柱技术. 它采用了原位聚合的技术,在空色谱柱 管中注入模板分子、 功能单体、 交联剂、 致孔剂、 引发剂的混合物,通过热 引发生成一根整体柱。它简化了色谱固定相的制备过程, 综合了两者的优点即 合成步骤简单、 原料利用率高、 无须装柱整体柱的形态可控性、 选择性好、 传质阻力低等等. 同时也克服了常规本体聚合制备 MIP 的分离效率低,研磨筛分 费时费力等缺点。 二、分子印迹聚合物整体柱的制备二、分子印迹聚合物整体柱的制备 图 2 分子印迹聚合物制备过程 分子印迹聚合物的制备过程可用图 2 来形象地表示1。首先，模板分子与 功能单体通过共价键或非共价键结合产生功能团和空间结构互补的相互作用， 形成配合物;第二，在过量交联剂的存在下，引发聚合，使模板分子一功能单体 配合物周围发生聚合反应，形成高度交联的具有一定机械性能的高分子聚合物; 第三，除去模板分子，得到功能团和空间结构与模板分子互补的分子印迹聚合 物。 目前常规的制备方法如下:将模板分子引发剂溶解在由功能单体、 交联剂、 致孔剂组成的混合溶液中,超声至完全溶解通入氮气 5min, 然后将此溶液加入 不锈钢柱管中,两端密封, 在 45 下恒温反应 12h,去掉密封头将其接到液相色 谱泵上用甲醇- 醋酸(体积比为 4：1)溶液充分冲洗至基线水平, 再做一组对照实 验即空白柱除不加模板分子外均按上述方法等同制备和处理. 1、 致孔剂 分子印迹聚合物的制备过程中，模板分子同功能单体形成的主一客体配合 物在一定的溶剂中可以稳定存在。在模板分子能够溶解的前提下，应当尽量选 用极性低，对氢键影响弱的有机溶剂，如甲苯、氯仿、二氯甲烷、二甲苯等， 因为在非共价型分子印迹过程中溶剂对模板分子与功能单体的自组装结构的影 响很大致孔剂的选择在分子印迹整体柱制备中至关重要,选择的致孔剂要满足以 下 3 个条件:能溶解模板分子、 功能单体、 引发剂和交联剂; 能形成大的通孔 和小的微孔, 从而保证流动相能在较低的压力下流过色谱柱,降低涡流扩散;对模 板分子与功能单体之间的相互作用干扰小 2。 2、 聚合温度 聚合温度主要是通过影响聚合反应中自由基引发剂的分解速率进而影响所 合成的聚合物的识别性能.制备分子印迹聚合物时,一般选择尽可能低的温度,但 也不是越低越好 3. 3、 最佳交联度的选择 交联剂是制备 MIPS 的一个重要因素。其类型及用量直接影响单位质量聚合 物中可交联的功能单体的数目和交联度，而单位质量 MIPS 中可交联的功能单体 的数目和交联度又直接影响 MIPs 的选择性和结合容量。交联剂的作用是使模板 分子和功能单体形成高度交联、具刚性的聚合物。分子印迹聚合物要求的交联 度很高(70 一 90%)，因此交联剂的种类受到限制。在分子印迹聚合物的制备中, 交联剂与单体的比例直接影响着聚合物的内部结构,为维持良好的特定空间构型, 一般需要控制较高的交联度通常高达 80%.但也有例外,比如在张倩倩的以普萘 洛尔为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,己二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂, 甲 苯和十二醇混合溶液为致孔剂,合成普萘洛尔分子印迹整体柱时,得出交联度为 85%时被模板分子的保留情况优于 80%的整体柱.因此,普萘洛尔分子印迹整体柱 的最佳交联度为 85%。 4、 模板分子与功能单体比例 因为单体模板比例对聚合物的识别能力影响非常大,所以我们考察其两者的 比例.若功能单体过多而模板分子过少,得到聚合物的识别位点数量就少,识别能 力就低, 同时非特异性吸附就严重;反之,也不能得到具有很好识别能力的聚合物. 同时会浪费昂贵的模板分子, 因而比例进行优化 4。 三、分子印迹聚合物整体柱的应用三、分子印迹聚合物整体柱的应用 分子印迹聚合物整体住在色谱分离、样品前处理、膜分离、仿生传感器和 固相萃取等方面具有广泛的应用。 1、分子印迹整体柱在液相色谱分离分析中的应用、分子印迹整体柱在液相色谱分离分析中的应用 基于分子印迹整体柱良好的特异识别性能和快的传质速率，其作为液相色 谱固定相，已广泛应用于混合物的分离和纯化。Matsui 等5首次采用原位聚 合法直接在液相色谱柱中合成了分子印迹聚合物。此类整体柱可用于分离相应 手性化合物的对映体，但柱效和分离能力有限，且负压高，未能得到相应对映 体化合物的分离谱图，因此在较长时期未能引起人们重视。随着分子印迹技术 的成熟以及分子印迹整体柱制备条件的不断改善和优化，分子印迹整体柱的分 离和识别性能得到了极大的提高，其在 HPLC 和毛细管液相色谱(Capillary liquid chromatography，CLC)分析中的应用越来越广泛。 1.1、分子印迹整体柱在高效液相色谱分析中的应用、分子印迹整体柱在高效液相色谱分析中的应用 1. 1. 1 手性化合物的拆分手性化合物的拆分 在天然和合成的药物中，许多手性化合物对映体的药理活性和毒性往往有 很大差异，有时甚至性质相反，因此在医药分析领域对映体或异构体的拆分尤 为重要。分子印迹整体柱对模板分子的立体结构具有较强的 “记忆”和保留能 力，其作为色谱固定相可有效地分离手性和非手性药物，并能预测化合物的洗 脱顺序。相比其它手性化合物拆分方法，分子印迹整体柱具有成本低、抗干扰 能力强、操作简单等优点。Huang 等6首次采用 30%(w% = m 单体 /m 总聚合 液 100%)的功能单体量制备了低密度(S)-萘普生印迹整体柱，并将其用作色 谱固定相，在 10 min 内成功地分离了萘普生手性化合物，分离度 R = 1. 55。Amut 等7制备了 S- ( )-氨氯地平印迹整体柱，并研究了该整体柱的 识别机理和选择性吸附性质，将其用于液相色谱中，在最优条件下实现了氨氯 地平消旋体的分离。杨伟杰等8以丙烯酰胺为功能单体原位聚合合成了二苯 甲酰- D-酒石酸印迹整体柱，在优化色谱条件的基础上，25 min 内基本实现了 二苯甲酰- D-酒石酸消旋体的手性分离，分离度达 1. 25。Sirc 等9采用紫外引 发原位聚合法合成了甲苯基磺酰- L-苯丙氨酸印迹整体柱，并研究了其形貌和色 谱特性。结果表明，该印迹整体柱较常规的填充柱对模板分子及其结构类似物 和对映体具有更好的分离能力。 1.1. 2 结构类似物的分离结构类似物的分离 结构类似物由于化学结构相似，模板分子和类似物与常规色谱柱固定相的 相互作用力相似，采用一般的分离方法很难分离。分子印迹整体柱作为色谱固 定相对模板分子及结构类似物具有不同的色谱保留能力，可用于结构类似物的 分离，但大多为小分子结构类似物的分离分析。目前，关于生物大分子蛋白质 的分离分析虽已有报道，但由于其制备过程中蛋白质的负载和印迹比较困难， 故仍处于研究初期。Liu 等10首次在水溶性介质中原位聚合制备了大孔细胞 色素 C(cyc) 印迹聚丙烯酰胺整体柱，将其用于 HPLC 中分离识别模板蛋白质， 成功地实现了 cyc 和溶菌霉素(Lyz)混合物的分离，两种蛋白的保留因子分别为 2. 0 和 1. 3。Lin 等11首次采用表面印迹法分别制备了牛血清白蛋白(BSA)和 Lyz 印迹大孔硅胶基质整体柱，并将其用于蛋白质分离。BSA 和 Lyz 在其对应 的分子印迹整体柱上的印迹因子分别为 9. 07 和 6. 52。此类型的整体柱兼具了 分子印迹的高选择性和硅胶基质整体柱的高分离效率，比二氧化硅印迹颗粒填 充柱和有机聚合物基质分子印迹整体柱具有更优异的色谱性能。表 1 总结了近 5 年来分子印迹整体柱作为 HPLC 固定相在结构类似物分离中的应用情况。 表 1 分子印迹整体柱在结构类似物 HPLC 分离中的应用 2 、分子印迹整体柱在样品前处理中的应用、分子印迹整体柱在样品前处理中的应用 作为一种新型的样品前处理材料，MIPs 已引起了众多分析工作者的广泛关 注 分子印迹整体柱结合了 MIPs 和整体柱的优点，具有良好的多孔结构 高的 选择识别性能和小的传质阻力，较填充型固相萃取材料具有更高的萃取率 它克 服了传统样品前处理技术溶剂消耗量大处理时间长 操作繁琐等缺点，集采样 萃取 浓缩于一体，可与气相色谱(GC) HPLC 毛细管电泳(CE)等仪器联用 前处理 分析的联用方式有在线分析和离线分析两种 复杂基体中痕量 超痕量物质的分 析依赖于高效和高选择性的样品前处理技术12 分子印迹整体柱能从复杂样品 中选择性地识别和富集目标化合物，从而减小基体干扰 目前，分子印迹整体柱 已广泛应用于复杂体系的样品前处理中，表 2 中列举了其作为预处理柱在食品 生物和环境样品分析前处理中的应用情况. 表 2 分子印迹整体柱在食品 生物和环境分析样品前处理中的应用 . 分子印迹整体柱还可用于中草药分析的样品前处理，即以已知的活性化合 物为模板分子合成相应的分子印迹整体柱，从而直接从复杂多样的中草药基质 中选择性富集该活性化合物及其结构类似物，避免了传统分离提取的非特异性 和低效性。Ou 等13制备了 L- THP 分子印迹整体柱，并将其用作固相萃取预 柱，与 C18 反相色谱柱联用，成功地实现了延胡索提取液中 L- THP 的在线富集 与分离，回收率为 91%。Li 等14将原儿茶酸印迹整体柱用于在线萃取刺蓟草 种子粗提液中的原儿茶酸，实现了原儿茶酸的制备和纯化，回收率为 86%，产 品的纯度高达 98. 7%。分子印迹整体柱还可用于药物中有效成分分析的样品前 处理。Zhang 15在玻璃管中原位聚合制备了士的宁印迹整体柱，并成功用于 万通筋骨片中士的宁的富集和纯化。 参考文献 1姜忠义.分子印迹聚合物的设计与制备J.高分子材料科学与工程，2004，20(3):25 毛 8. 2 Li Yi r