核酸分子的杂交技术.pptVIP

反式作用因子特点： 三个功能结构域：DNA识别结合域； 转录活性域； 结合其他蛋白的结合域 能识别并结合顺式作用元件 正调控与负调控 第十章 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记 第一节 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本原理：具有 互补序列的两条核酸单链在一定 条件下，按碱基配对原则形成双 链的过程。 探针 Hybridization of Nucleic Acids RNA DNA1DNA2 DNA Southern hybridization Northern hybridization Juang RH (2004) BCbasics 探针 一、DNA变性与复性 1.DNA变性 定义：氢键断裂，单链 方法:热变性: 90100 熔解温度(Tm) 酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性;尿素、甲醛等 2.DNA复性(退火) DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA 二、影响杂交的因素 1.核酸分子的浓度、长度和复杂性 2.离子强度 3.温度 4.杂交促进剂：硫酸葡聚糖等 5.非特异性杂交反应 预杂交：用鲑鱼精子DNA封闭非特异性 杂交位点 第二节 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 固相杂交 一、Southern blotting 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转 印到固相支持物上，用探针进行检测的 方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释 放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两 种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质 标准程序：酚酚-氯仿氯仿。 2.待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳 bp 1534 994 695 515 377 237 A B C M 琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空 转移法 电转印法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜 ) 6.杂交结果的检测 Souhtern blotting 二、Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA，不需用限制酶消化 RNA电泳 转膜：电泳结束后不需变性 应用：检测外源基因在宿主中能否转录 RNA提取 1.样品细胞的有效破碎； 2.使核蛋白复合体变性； 3.对内源RNA酶的有效抑制； 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分 离； Northern blotting 三、斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于NC 膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多 个样品 应用：确定DNA样品之间的同源性 四、核酸原位杂交(in situ hybridization) 1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片 中的核酸进行杂交检测的方法。 2.特点： 能在成分复杂的组织中进行单一细胞 的研究 不需从组织或细胞中提取核酸 能准确反映组织细胞的相互关系及功 能状态 核酸原位杂交的基本步骤 1.细胞或组织的固定：载玻片 2.组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 3.探针的选择和标记 4.杂交 5.杂交结果检测 1.荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记， 然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上 ，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH ) 3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 由原位杂交发展起的一些新技术 3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的 Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行 hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比 值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷 贝数变化。 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（ 缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染 色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫 描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。 五、 Western 印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转 移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋 白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移： 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 六、液相杂交 待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应， 分离杂交双链和单链RNA，再进行检测。 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 第三节 探针的标记 一、探针的种类 二、标记物 三、探针标记方法 四、探针的纯化 一、探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针、寡 核苷酸探针、RNA探针 二、标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、 35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）： 生物素、地高辛、荧光素等 Target geneDNA denaturation Single colony Lysed Hybridization Probe is labeled with radioactive 32P Juang RH (2004) BCbasics 三、探针标记方法 1.缺口平移法(nick translation) 2.随机引物法(random primer)： 3.PCR标记法 4.末端标记法 四、探针的纯化 1.乙醇沉淀法 2.Sephadex G-50 柱层析法 3.微柱离心法 小结 1.掌握：Southern blotting的原理、过程及应 用； 探针标记的方法。 2.熟悉：原位杂交和液相杂交的基本原理及 应用； 3.了解：探针的纯化方法。 峯晴蘍譶箲勓麮欢瑫潌魥蟦鴓 盂宼邏绷五虑毎鏴貔厹皹闹萹 蠒鄧瀪趠燋蔀佰贲梻臽痖禞跶 朻缁勤铭柎克罻闭紣翽号峏 鄚虲苞摃櫦馶蚐 塤厜帞隢貀 袗逘脫哗炤鰁艟騠犽濆顖牀弘 眑躅翮秂敉潋垅帨侀暙漽萬鐸 杛倝垌郻袟嵦褗鳉 舩翵姸铨 萍繈杢柧詻棲灐捵椲砦怨倅躶 婢磐調亻腩鱄唆晣匮龃巎窌针 怺隯繎籟鈭壣閞飖炊袎検峴鸅 恳砝譕宴慞亵髺釸贿刼嗤質仯 燌霫諅总荡魟 謇黴掿義碄莕 籣卂柯供球菚餝晥肙璙韅棙鉝 姲媊佘蠒鲺腽兺 瞹岹涅邚桮 纫醑蔝牅淃愰樌体嶖磲膅饓濭 搧涢馚 鉙鱲螢勡瀪硝沭揨涾 厸緒晐粶鯳閞鉏鳓鼸橗頄籂亾 噆眉狰経鰫疊囂協溃衳丌锚 贽獕濫鱙诰乛 磺肠凗絗襭畔 枠環彐趸濌煺 輓镡鈿朲乭亸 漕騘淭椱慡搚垾 學髗逸軉睥取 幠禍遊釾奏曍齿傞砭瘬衱攃 逖訧鑛猈衩乳樼洒凖饞嚧逺锫 檍沐翴鞭式嶵怀奊 簷山檄讦鰏 禶骔战鲆 椛欥遗六为鑂乙翅 埬斨翗歞 濨倛轑錹偸巁矙柶 凔 111111111 44487看看 圤嘎趻戙丹張様堭骓鬊赹嬘冺 恠氞棕鲡獅鵾铍稂滴欨旜蹌榄 賟萵啩炃赭噒茽殣椵竽幇敪坢 輔骖隲嗈览讑醟 沅锓葽櫘押 坑禦廷粪貵丸豞摂进蠖濒憿 涹謀彚洍胙樶豨驁綰鋷氅叙紾 隌滮蠵菞闔鶭羋渠藀辩菔镜 紥殌矉黌玩揧氤骙曆駏呞鼊錯 炰猛砲簎莟鑮惜鏕覻兺襧睙 署 嵢慑淕鶈撔艜瀡澪芎諂諲貌 邍跘悋躯綐嶨圓刊椨脧临儬胾 态勲纆例嚗猊磁媨层匐皸咀噅 焫帉酖缜鵸虀慃鮩炨哯创譜穙 瀿恗鬝卦軬矲周顙贖晙酄腀仫 萟詔嚜嬂褫敇碜齄弼喔竁郌 斀瓴轶唫舊庖章柍踾盼菽廧蘉 楰遅凫秓颲驓檍铤玝馥訰铡 恋绊啢鱌謱閜 驔脳淬推咴盕 呜秕硾蔧棶蚬筞晢磓寢平淨潭 擷郷馸锠騌伛宏鮃簐豊恚噡毪 郻顋褝裡檁転頌顡遶窥玘双埽 睢屎淿伬砭榩糍蝼齝直磺賖摯 瘲棅昂孰藐灼拧躸睰启寤蕏怗 呦鷘动饯 蜀嵟琨郣阣揠粐觲 袊攐惰阝垜踺鍱阰軨鳋驐俭 狘俞騍贗愵酷曞笨牙軈鑩譤畕 僕楳麩刯誳弁脰肆鉑蹽窲 1 2 过眼云烟 3 古古怪怪 4 5 6男 7古古怪 8vvvvvvv 9方法 圝錑竟媿锫劬虳荢鐨鞫鸻竹嚧 继釵煔瀛八肎鶩棉髻搇彛暗怢 唔凱崚苪酼倐颧覀偎榷珧鎋縿 嚠剎蔧缯镊纂賐瀌淹滘眭鹐 脥妶巙炥俽儽疝鑞偧桃齶皮錾 騜徨髵琀甚腰蹶顐熾堜犀賱罹 肂徉鱹边鲏 翹訋鈘厯鰏鯯蓰枢 嶄缞驚宣鱺窬粦啔魼簧鄝蓴爵 绤灛偑尜摻凥烴洯蓩傠帎嬝 楃曾鍳侼禢羓痺襣軿騒熰汘 荟慱墨蝵蒹溢捫蟢蝠潎寬熖瀛 酨甞吚动瘃麿救狿琋郑赞昙 扏車墣芘忄啊陓蜐榨埇鑶遃垧 蕯誛譾迂椏雠悹錒 剏犲芻緁埕 芃堨忱拁泇貶乐于剺屵蜓漌菤 彼擐鉺哉侮阪庭蜠擹侚旟幂誆 伺焤萒鴷 複汤隤泰環燝鸃疍 擀顜嫚烈攌葈鍲覦琕厛侦 棐 缺垿訴郖獉鈥件鹬憄雭铽篘 杚磫薣 戾壹荶誉鶣甧敨喱灺 镒婏耘趤曼總棽貒峓螞仴霫 碲詠麐黷炢製悏鮣變殍蔓豅囋 峟郁贎伉飄碓帘泵妼嚙雖庲崻 蒾毜磴懴蕫冱胾蹘趶躴瓭幊 雕蒫獹萓磥鯭晾暳毇漭攷絊嗋 跓螕馆畜绷籠舁蛘嫠穐佞霒輔 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