《核酸分子杂交技术》PPT课件.ppt

核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 李如波李如波 中国医科大学法医学院中国医科大学法医学院 核酸分子杂杂交技术术(Nucleic acid molecular hybridi- zation)是检测检测 核酸分子间间序列同源性的一种技术术。 不同来源的核酸单链单链 只要彼此间间有一定的互补补序列 ，即可按碱基配对规则对规则 以氢键氢键 相结结合。通常是先对对一种 核酸进进行标记标记 （如放射性同位素35S，32P或生物素等）作 为为探针针，去探测测另一种核酸序列。核酸分子杂杂交可以在 DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进间进 行。 由于这这种技术术具有高度的特异性和灵敏性，已广泛 应应用于生物学、医学科学研究，临临床传传染病和遗传遗传 病的 诊诊断。 一、核酸分子杂杂交的基本原理 从化学和生物学意义义上理解，探针针(Probe)是一种分 子，它带带有供反应应后检测检测 的合适标记标记 物，并仅仅与特异靶 分子反应应。 抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲亲和素-生物素 、受体-配体(ligand)以及互补补核酸间间的杂杂交均属于探针针- 靶分子反应应。 蛋白质质探针针（如抗体）与特异靶分子是通过过混合力（ 疏水、离子和氢键氢键 ）的作用在少数特异位点上的结结合，而 核酸探针针与互补链补链 的反应则应则 是根据杂杂交体的长长短不同， 通过氢键过氢键 在几十、几百甚至上千位点上的结结合。 核苷酸经经某一原子、功能基团团或长侧链长侧链 修饰饰后仍有 可能进进行碱基配对对，这这取决于修饰饰的部位和修饰饰物的性 质质。 标记标记 的探针针每1kb只掺掺入10-30个修饰饰碱基，仅仅4- 12的单单个碱基被修饰饰的类类似物取代。 尽管掺掺入位点处处的碱基配对较对较 弱或不存在，但对对整 个杂杂交分子的稳稳定性影响很小。 二、核酸探针的种类二、核酸探针的种类 根据标记方法不同可分为：根据标记方法不同可分为： 放射性探针 非放射性探针 根据核酸的性质不同又可分为：根据核酸的性质不同又可分为： DNA探针 单链(ssDNA) 双链(dsDNA) RNA探针 cDNA探针 cRNA探针 原位杂交可分为DNA-DNA，cDNA-RNA，RNA- RNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式。 三、核酸探三、核酸探针针针针的的标记标记标记标记 和和检测检测检测检测 最早采用也是目前最常用的核酸标记标记 方法是放射性 同位素标记标记 ，常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量 高，信号强，最常用。放射性同位素探针虽针虽 然灵敏性高， 但却存在辐辐射危害和半衰期限制。由于存在上述缺点，近 年来，人们们在寻寻求非放射性标记标记 物方面取得了很大进进展 。国际际上已有多家公司相继继推出多种非放射性探针标记针标记 试剂试剂 盒，在国内也具备备生物素类标记类标记 物的生产产能力，并 有相应试剂应试剂 出售。 目前非放射性标记标记 物有以下几类类：金属如Hg；荧荧光 物质质如FITC；半抗原如地高辛（DIG）；生物素；酶类类 如辣根过过氧化物酶（HRP）；半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（ AKP）等。 四、核酸探四、核酸探针标记针标记针标记针标记 及及显显显显示方法示方法 （一）核酸探（一）核酸探针针针针的放射性的放射性标记标记标记标记 技技术术术术 1. 1. 缺口平移缺口平移标记标记标记标记 方法方法 （nick transcriptionnick transcription） 原理：首先用原理：首先用DNADNA酶酶在双在双链链链链DNADNA探探针针针针的一条的一条链链链链上制造一个缺上制造一个缺 口（口（nicknick），缺口），缺口处处处处形成形成3-3-羟羟羟羟基末端，在大基末端，在大肠肠肠肠杆菌杆菌DNADNA聚合聚合酶酶I I的的 催化下将核苷酸残基加在催化下将核苷酸残基加在3-3-羟羟羟羟基本上。基本上。 同同时时时时根据大根据大肠肠肠肠杆菌杆菌DNADNA聚合聚合酶酶I I的的 53 53 核酸外切核酸外切酶酶活性，此活性，此酶酶将缺口将缺口55端端 核苷酸依次切除，其核苷酸依次切除，其结结结结果是在缺口的果是在缺口的55端端 不断消除核苷酸而在不断消除核苷酸而在33端端则则则则依次添加核苷依次添加核苷 酸，从而使缺口沿着互酸，从而使缺口沿着互补补补补DNADNA链链链链移移动动动动， 故称缺口平移。根据故称缺口平移。根据这这这这个原理，用个原理，用-32 32P P dATPdATP置置换换换换先前存在的核苷酸，先前存在的核苷酸，则则则则可制可制备备备备 高活性的高活性的DNADNA探探针针针针，能，能满满满满足大多数足大多数杂杂杂杂交交 的要求。的要求。 2. DNA2. DNA快速核酸快速核酸标记标记标记标记 大肠肠杆菌聚合酶I经经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽肽 链链，其中分子量为为76kD的大片断称为为Klenow片段。该该 酶具有完整聚合酶I的53 核酸聚合酶活性和35 核 酸外切酶活性，但缺乏53 核酸外切酶活性。利用 Klenow片段可以填补补由限制性酶消解DNA所产产生的3凹 陷末端。因此，用这这种方法可以标记标记 双链链DNA的凹陷3 末端。用Klenow片段标记标记 末端一般只用一种-32P dNTP，加入反应应的-32P dNTP取决于延伸的5末端序 列。 3. 3. 用用T4T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶标记标记标记标记 DNA5DNA5末端末端 寡核苷酸探针针或短的RNA和DNA探针针可选选用此方 法。T4多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由 T4噬菌体感染的大肠肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的 -磷酸转转移至DNA或RNA的5-OH末端。在过过量ADP存 在时时，也可促进进磷酸交换换反应应，使PNK将DNA末端5 磷酸转转移到5ADP上生成ATP，然后催化-32P dNTP上 的标记标记 磷酸转转移至DNA的5末端，从而使DNA重新磷 酸化，并得到标记标记 。注意要用碱性磷酸酶去掉磷酸基团团 。 4. 4. 随机引物延伸随机引物延伸标记标记标记标记 方法方法 是从单链单链 DNA或RNA模板合成高比活 性的32P标记标记 探针针所选选用的方法。原理: 使 长长6-8nt的寡核苷酸片段与变变性的DNA或 RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下 ，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段 为为引物引发发DNA链链的合成，在反应时应时 将 -32P dNTP掺掺入合成链链，即得到标记标记 。变变 性处处理后，新合成链链（探针针片段）与模板 解离，即得到无数各种大小的探针针DNA。 因为为所用真核苷酸片段很短，在低温条件 下可与模板DNA随机发发生退火反应应，因此 ，被称为为随机引物(random primer)。这这种 随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼鱼精DNA制 备备。 5. 5. 聚合聚合酶酶链链链链反反应应应应 聚合酶链链反应应(polymerase chain reaction, PCR)是一 种分子生物学新技术术，由于美国Cetus公司人类遗传类遗传 学部 的Kary B. Mulli于1985年创创立。该该技术术利用两个与相反链链 杂杂交并随着于靶DNA两侧侧的寡核苷酸引物经经酶促合成特异 的DNA片断，包括膜板变变性、引物退火和引物延伸三个步 骤骤的反复循环环，最终终两引物所夹夹靶DNA得到千万倍以上的 扩扩增。可用来标记标记 高比活性的DNA探针针，PCR技术术有很 高的特异性，可以在1-2小时时内大量合成探针针DNA片断。 如果在底物中加入-32P dNTP或其它标记标记 的dNTP ，则则探针针DNA合成过过程中可得到很好的标记标记 ，标记标记 物掺掺 入率可高达70-80。PCR标记标记 技术术特别别适用于大规规模 检测检测 和非放射性标记标记 。该该法的特点是要合成一对对特异性 PCR引物。 6. 6. 体外体外转录转录转录转录 法法 先把先把DNADNA片段克隆到有噬菌体片段克隆到有噬菌体转录转录转录转录 启启 动动动动子的子的载载载载体中，然后在体中，然后在RNARNA聚合聚合酶酶的作用的作用 下，以下，以DNADNA为为为为模板，以含有模板，以含有标记标记标记标记 的三磷酸的三磷酸 核糖核苷核糖核苷为为为为原料，原料，对对对对启启动动动动子下游的序列子下游的序列进进进进 行行转录转录转录转录 。所。所谓谓谓谓启启动动动动子子(promotor)(promotor)，又称启，又称启 动动动动基因，是入出基因，是入出DNADNA分子上可与分子上可与RNARNA聚合聚合 酶酶特异性特异性结结结结合而使合而使转录转录转录转录 开始的部位，而启开始的部位，而启 动动动动子本身并不被子本身并不被转录转录转录转录 。 体外体外转录转录转录转录 常用的噬菌体常用的噬菌体转录转录转录转录 启启动动动动子有子有 沙沙门门门门氏菌噬菌体氏菌噬菌体SP6SP6和大和大肠肠肠肠杆菌噬菌体杆菌噬菌体T3T3， T7T7。当二个不同的噬菌体。当二个不同的噬菌体转录转录转录转录 启启动动动动子子结结结结合合 在在载载载载体多克隆位点的两体多克隆位点的两侧侧侧侧，而且互相呈相，而且互相呈相 对对对对方向方向时时时时，则则则则可分可分别别别别启启动动动动插入插入DNADNA片段片段 SenseSense和和AntisenseAntisense的的转录转录转录转录 。 转录转录转录转录 前要用限制前要用限制酶酶先在先在cDNAcDNA插入点的插入点的 下游切割，使下游切割，使DNADNA直直线线线线化，做化，做为为为为模板，以模板，以 标记标记标记标记 的三磷酸核糖核苷的三磷酸核糖核苷为为为为原料，原料，转录转录转录转录 合成合成 RNARNA探探针针针针。 （二）核酸探（二）核酸探针针针针的非放射性的非放射性标记标记标记标记 技技术术术术 1. 1. 光敏生物素光敏生物素标记标记标记标记 核酸核酸 有二种光敏生物素：均由一个光敏基团团、一个链链接 臂和一个生物素基团组团组 成。 光生物素：光生物素：光敏基团团是-N3，在光作用下可与核酸中的碱 基结结合。 补补补补骨脂素生物素：骨脂素生物素：光敏基团团是补补骨脂素，在光照（320- 400m）下，可与单链单链 或双链链DNA发发生反应应，反应应主要 在T上，C上也有一定程度的反应应。 光敏生物素的连连接臂含有6-12个碳原子，用以减少 探针杂针杂 交时时的空间间位阻。此方法简单简单 ，灵敏度可达ng水 平 ，可用于外源基因的检测检测 。 2. 2. 酶酶促生物促生物标记标记标记标记 核酸核酸 以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP, Bio-7-dATP, Bio-11-dCTP）等代替相应应 32P标记 标记 的脱 氧核苷三磷酸，以DNA聚合酶作用掺掺入DNA。Bio- dUTP代替dUTP，Bio-dATP代替dATP，Bio-CTP代 替dCTP。 Bio-11-dUTP的11是指生物素基团团与脱氧核苷酸 之间连间连 接臂的碳链长链长 度。 常用的酶促生物标记标记 DNA的方法有缺口平移法 和随机引物延伸法。 3. 3. 寡核苷酸的生物素末端标记寡核苷酸的生物素末端标记 5-5-磷酸的化学标记法：磷酸的化学标记法： 将寡苷酸的5-磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀亚胺生物素， 将生物素基团连接到磷酸酰胺基上。 3-OH3-OH的酶捉标记法：的酶捉标记法： 用末端转移酶将Bio-11-dUTP加于其3-OH端，脱去一个焦磷酸 。 4. 4. 酶标酶标DNADNA 标记试剂：标记试剂：辣根过氧化物酶（HRP）；碱性磷酸酶（AP） 通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP- PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合，使 HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。 5. 5. 酶标寡核苷酸酶标寡核苷酸 核苷酸核苷酸5-5-末端标记末端标记HRPHRP法：法： 在HRP中产生一个-SH反应基团，在寡苷酸合成终了加在5- 端，带一个C6的-HS，与活化的HRP反应生成5-HRP寡苷酸。 内中标记内中标记APAP法：法： 在合成寡核苷酸过程中将一个5带连接臂及CF3基团的尿苷3 亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP 即得到AP标记的寡核苷酸。 6. DNA6. DNA半抗原标记半抗原标记 其原理与Bio-11-dUTP相同 ，只是用毛地黄甙抗体检测标记 在DNA上的半抗原分子地高辛（Digoxigenin，DIG）。 （三）非放射性探（三）非放射性探针针针针的的显显显显示体系示体系 1. AP1. AP显显显显色体系色体系 ASO-AP+BCIPBCI-OH+Pi BCI-OH+NBT紫色 ASO：等位基因特异的寡核苷酸 BCIP：5溴-4氯氯-3吲哚吲哚 磷酸 NBT：四氮唑蓝唑蓝 Pi：磷酸 2. HRP2. HRP显显显显色体系色体系 HRP+H2O2HRPH2O2 ODA-NH2+HRPH2O2 ODA-N=ODA/棕色 +HRP+H2O ODA；邻邻-联联茴香胺 3. ABC3. ABC显显显显色体系色体系 DNA-B+SA-APDNA-B-SA或 DNA-B+SA+BAPDNA-B-SA-BAP SA：streptavidin(链链霉亲亲合素) BAP：生物素化的磷酸酶 B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(亲亲合素-生物素-酶复 合物)。 4. 4.非放射非放射发发发发光自光自显显显显影影 若将AP或HRP的显显色底物根据光化学原理换换成一种 酶解后产产生的光子的化合物，可用自显显影技术术曝光X线线 片显显示。 HRPHRP发发发发光自光自显显显显影：影：氨基苯-甲酰肼酰肼 在HRP与H2O2作用下氧 化为为氨基苯二甲酸，同时时放出N2及发发光。 APAP发发发发光自光自显显显显影：影：发发光底物金刚烷刚烷 二氧丁环环磷酸盐盐（ AMPDD），其磷酸二脂键键在AP作用下水解一个磷酸，进进 而由分子内过过氧键键提供能源分解并产产生金刚酮刚酮 和激发态发态 的甲基间间-氧苯甲酸阴离子，恢复到基态时发态时发 光。 五、核酸分子五、核酸分子杂杂杂杂交方法和交方法和类类类类型型 （一）、固相膜核酸分子（一）、固相膜核酸分子杂杂杂杂交交 将参加反应应的一条核酸链链先固定在固体支持物上，一 条反应应核酸链链游离在溶液中。 固体支持物有硝酸纤维纤维 素滤滤膜、尼龙龙膜、乳胶颗颗粒， 磁珠和微孔板等。杂杂交后未杂杂交的游离片断容易洗去，膜上 留下的杂杂交物容易检测检测 ，并能防止和DNA自我复性等优优点 ，故该该法最为为常用。 类类型：菌落原位杂杂交、斑点杂杂交、狭缝杂缝杂 交、 Southern印迹杂杂交、Northern印迹杂杂交、细细胞或组织组织 原位 杂杂交和夹夹心杂杂交等。 方法：方法： 1. 1. DNADNA变变变变性：性：变变性能使DNA双链链解开，常用SSC（ 0.1mol/L SSC, 15mmol NaCl-1.5mmol 柠柠檬酸三钠钠）碱变变 性。 2. 2. 膜上固定：膜上固定： 20SSC中转转膜-毛细现细现 象，固定，80下， 2小时时或紫外线线下1分钟钟（Cross link）。 3. 3. 预杂预杂预杂预杂 交：交：塑料袋中预热预热 60，预杂预杂 交液中：6SSC， 0.01molEDTA，5Denhardt氏液，0.5SDS，100 g/ml 变变性鲑鱼鲑鱼 精DNA 4. 4. 杂杂杂杂交：交：杂杂交液中的组组成：6SSC，0.01molEDTA， 5Denhardt氏液，0.5SDS，100 g/ml变变性鲑鱼鲑鱼 精DNA 及探针针。 5. 5. 洗膜：洗膜：2SSC-0.5SDS， 0.1SSC-0.5SDS，60 2 小时时。 6. 6. 显显显显色：色：放射自显显影；感光显显影。 种种类类类类： A A：菌落原位：菌落原位杂杂杂杂交交(Colony (Colony in in situ situ hybridization)hybridization)：是将细细 菌从培养平板中转转移到硝酸纤维纤维 素膜上，然后再将滤滤膜 上的菌落裂解以释释放出DNA。将DNA烘干固定膜上与标标 记记的探针杂针杂 交，放射自显显影，检测杂检测杂 交信号，与平板上 的菌落对对位。 B B：斑点：斑点杂杂杂杂交交(Dot (Dot blot)blot)：是将被检标检标 本点到膜上，烘烤固 定，简简便，快速，可做半定量分析，一张张膜上可同时检时检 测测多个样样品。 C C： Southern Southern 印迹印迹杂杂杂杂交交(Southern (Southern blot)blot)：将DNA标标本用限 制性内切酶消化后，经琼经琼 脂糖凝胶电电脉分离各酶解片断 ，然后经经碱变变性，Tris缓缓冲液中和（及）高盐盐下通过过毛 细细作用，将DNA从凝胶中转转印到硝酸纤维滤纤维滤 膜上，烘干 后即可用于杂杂交。杂杂交后放射自显显影显显示与探针针互补补的 DNA酶解片断。是研究DNA图谱图谱 的基本技术术，在遗传遗传 病 诊诊断、DNA图谱图谱 分析及PCR产产生分析生平方面有重要价 值值。 D D：NorthernNorthern印迹印迹杂杂杂杂交交(Northern (Northern blot)blot)：是一种将RNA从 琼琼脂糖凝胶中转转印到硝酸纤维纤维 膜上的方法。转转印方法与 DNA相似，但是在进样进样 前用甲醛醛使RNA变变性，而不用 NaOH，因为为会水解RNA的2-羟羟基团团。 E E：组织原位杂交：组织原位杂交：简称原位杂交，指组织或细胞的原位 杂交，组织或细胞经适当的处理后使细胞通透性增加，让 探针进行细胞与DNA或RNA杂交，因此可以确定探针的互 补序列在细胞内的空间定位，具有重要的生物学和病理学 意义。染色体DNA杂交可显示特定序列在染色体上的定位 ，与RNA杂交或显示特定RNA在细胞中或组织中的定位。 探针可以是双链或单链DNA，也可是RNA探针。长度以 100-400nt为宜。寡核苷酸探针（16-30nt）能自由地出入细 胞和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，是优选探针 。 （二）、液相杂交（二）、液相杂交 参加反应的两条核酸链都在溶液中，是一种最早且操 作简便的杂交类型，虽有时被应用，但不如固相杂交普遍 ，其原因是杂交后的过量未杂交探针在溶液中去除较为困 难和误差较高。近来有商业性基因探针诊断盒的应用。 原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂杂交技术简术简 称原位杂杂交(in situ hybridization)，是应应用已知碱基顺顺序并带带有标记标记 物的核 酸探针针与组织组织 、细细胞中待检测检测 的核酸按碱基配对对的原则则 进进行特异性结结合而形成杂杂交体，然后再应应用与标记标记 物相 应应的检测检测 系统统，通过组织过组织 化学或免疫组织组织 化学方法在被 检测检测 的原位形成带颜带颜 色的杂杂交信号， 在显显微镜镜或电电子显显 微镜进镜进 行细细胞内定位。 这这一技术为术为 研究单单一细细胞中DNA和编码编码 各种蛋白质质 、多肽肽的相应应mRNA的定位提供了手段。使从分子水平研 究细细胞内基因表达及有关基因调调控提供了有效的工具，视视 为组织为组织 化学或免疫细细胞化学中革命性的突破。 原位杂杂交技术术已应应用于基础础研究： 基因组图组图 (gene mapping)， 转转基因检测检测 ， 基因表达定位(localization of gene expression) , 核DNA和RNA的mRNA的排列和运输输(arrangement and transport of mRNA)， 复制(replication)， 细细胞的分类类(sorting of cells) 临临床应应用： 细细胞遗传遗传 学(cytogenetics)， 产产前诊诊断(prenatal diagnosis)， 肿肿瘤和传传染性疾病的诊诊断， 生物学剂剂量测测定(biological dosimetry)， 病毒学的病源学诊诊断 一、原位核酸分子一、原位核酸分子杂杂杂杂交技交技术术术术的的发发发发展展 原位杂杂交1969年由美国耶鲁鲁大学Gall和Pardue首先 创创立的，他们们用爪蟾核糖体基因探针针与其卵母细细胞杂杂交 ，确定该该基因定位于卵母细细胞的核仁中。 与此同时时，Buogiorno-Nardelli和Amaldi，John及 其同事等相继继利用同位素标记标记 核酸探针进针进 行了细细胞或组组 织织的基因定位。 Ortho（1970）应应用3H标记标记 的兔乳头头状瘤病毒cDNA 探针针在兔乳头头状瘤组织组织 的冰冻冻切片进进行杂杂交，首次用原 位杂杂交技术检术检 出了病毒DNA在细细胞中的定位。 二、二、 原位分子原位分子杂杂杂杂交技交技术术术术的基本方法的基本方法 基本方法包括： 1. 杂杂交前准备备：包括固定、取材、玻片和组织组织 的处处理， 增强核酸探针针的穿通性和减低背景染色等； 2. 杂杂交； 3. 杂杂交后处处理； 4. 显显示：包括放射性自显显影和非放射性标记标记 的组织组织 化学 或免疫组织组织 化学显显色。 （一）、固定（一）、固定 固定的目的是为为了保持细细胞形态结态结 构，最大限度 地保存细细胞内的DNA或RNA的水平；使探针针容易进进入 细细胞或组织组织 。DNA比较稳较稳 定，mRNA易被酶降解。所 以取材后应应尽快冰冻冻或固定。 1. 最常用多聚甲醛醛固定液，因其不会与广泛的交叉连连 接，不会影响探针针穿透入细细胞或组织组织 。 2. mRNA原位杂杂交时应时应 将组织组织 固定于4多聚甲醛醛磷 酸缓缓冲液中1-2h，在冰冻冻前浸入15蔗糖中4过过夜， 次日切片或保存于液氮中。 3. 组织组织 也可在取材后直接置于液氮中冷冻冻，切片后将 其浸入4多聚甲醛约醛约 10min空气中干燥后保存于-70 ，可保存数月。 4. 福尔马马林固定、石蜡包埋的切片对检测对检测 DNA或 mRNA有时时也可获获得杂杂交信号，但由于与蛋白质质交联联 的增加，影响核酸探针针的穿透，因而杂杂交信号常低于 冰冻冻切片。同时时在包埋的过过程中可减低mRNA的含量 。 （二）、玻片和（二）、玻片和组织组织组织组织 切片的切片的处处处处理理 1. 1. 玻片的玻片的处处处处理：理：洗涤剂涤剂 浸泡，清水冲洗；弱酸中浸泡 ，冲洗；酒精中浸泡，冲洗，最后蒸馏馏水冲洗，烘 干，高热灭热灭 菌。粘附剂剂涂片：有三种： 铬矾铬矾 -明胶液； 多聚赖赖氨酸（PolyLLysine） ； APES(3-amino propyltriethoxy salane，氨丙基三乙 氧基硅烷烷)。 一般2APES丙酮酮液中浸泡10秒，然后丙酮酮中洗1 分钟钟。 2. 2. 增增强强组织组织组织组织 的通透性和核酸探的通透性和核酸探针针针针的穿透性的穿透性 常用的方法：常用的方法： 去垢剂剂(detergent)或称清洗剂剂：稀释释Triton-X 100， 消化酶：蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋 白酶和淀粉酶(diastase)等，注意不要过过度。 蛋白酶K(proteinase K)的消化作用的浓浓度及孵时间时间 视组织视组织 种类类、应应用固定剂剂的种类类、切片的厚薄而定。 一般应应用1g/ml（于0.1mol/L Tris-50mmol/L EDTA， pH8.0中）， 在37下孵育15-20分钟钟。 3. 3. 减低背景染色：减低背景染色：杂杂交后的酶处处理和洗涤涤均有助于减低 背景颜颜色。在多聚甲醛醛固定后浸入乙酸酐酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电电效 应应，减少探针对组织针对组织 的非特异性背景染色。预杂预杂 交是 减低背景染色的一种有效手段，预杂预杂 交液与杂杂交液的区 别别在于前者不含探针针和硫酸葡聚糖(dextran sulphate)， 可达到封闭闭非特异性的杂杂交目的，减低背景染色。在杂杂 交后洗涤涤中用低浓浓度的RNA酶溶液（201g/ml）洗涤涤一 次，以减低残留的内源性的RNA，减低背景染色。 4. 4. 防止防止RNARNA酶酶的的污污污污染：染：整个实验过实验过 程戴消毒手套，器 具高温消毒（240）。溶液配制用DEPC水。 （三）、（三）、杂杂杂杂交：交： 杂杂交(hybridization)是将杂杂交液滴于切片组织组织 上， 加盖硅化的盖玻片，或用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片 ，防止孵育过过程中杂杂交液的蒸发发。切片放于5SSC或 2SSC溶液的湿盒中进进行孵育。SSC：(standard saline citrate) （四）、（四）、杂杂杂杂交后交后处处处处理：理：不同温度，不同盐浓盐浓 度的漂洗。 一般的原则则是盐盐溶液浓浓度由高到低而温度由高到低。注 意漂洗过过程中切勿干燥。 （五）、（五）、显显显显示（示（检测检测检测检测 系系统统统统）前述 （六）、（六）、对对对对照照实验实验实验实验 和和结结结结果的判定果的判定 1. 1. 将cDNA与cRNA探针进针进 行杂杂交（吸收实验实验 ） 2. 2. 与非特异性（载载体）序列和不相关探针杂针杂 交（置换实换实 验验） 3. 3. 将切片用RNA酶或DNA酶进进行预处预处 理后进进行杂杂交， 用同义义探针针(sense probe)进进行杂杂交。 4. 4. 以不中核酸探针杂针杂 交液进进行杂杂交（空白实验实验 ）。 5. 5. 组织对组织对 照用已知确定为为阳性或阴性组织进 组织进 行杂杂交对对 照。 6. 6. 用未标记标记 探针杂针杂 交，进进行对对照。 三、三、 RNARNA原位核酸杂交方法原位核酸杂交方法 （一）、基本原理（一）、基本原理 是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞或组织 内RNA表达的一种原位杂交技术。 基本原理同前述 与与DNADNA杂交区别：杂交区别： 1. 1. 探针不同，避免了应用双链DNA探针在杂交反应中 两条链的复性与第二条链竟争性杂交；RNA杂交体 稳定，杂交后RNA酶洗脱，特异性强。 2. 2. 检测目的不同：内源性基因如细胞内固有基因、异 常基因和变异基因和外源性基因，如细菌或病毒 3. 3. 有较高的灵敏度。 不足之不足之处处处处： 1. 1. 不同种类类探针针的选择选择 、制备备和标记标记 要适合靶核酸和组 组 织织的特点； 2. 2. 有效制止组织组织 和细细胞内RNA降解； 3. 3. 实验过实验过 程中严严防RNA酶污污染； 4. 4. 对杂对杂 交信号有效的放大和技巧； 5. 5. 阳性结结果的判定，不仅仅要有阳性或阴性标 标本对对照，有 条件的还观还观 察Northern杂杂交和免疫组织组织 化学对对同一组组 织织的冰冻冻切片或石蜡切片中，基因及其产产物两者表达 之间间关系； 6. 6. 实验过实验过 程中熟练练运用技术术是杂杂交成功的关键 键。 （二）、（二）、RNARNA探探针针针针 种种类类类类： 1. 1. cRNAcRNA探探针针针针：是以cDNA为为模板，通过过体外转录获转录获 得 。 2. 2. 寡核苷酸探寡核苷酸探针针针针：以核苷酸为为原料，通过过DNA合成仪仪 合成。 标记标记标记标记 ： 1. 1. 酶酶反反应应应应法：法：末端标记标记 法，将标记标记 物导导入线线型DNA或 RNA的5端或3端的一种标记标记 法，一般携带带的标记标记 分子 较较少。 2. 2. 体外体外转录转录转录转录 法：法：是一种与克隆片段序列相同的单单RNA探针针 的方法。先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录转录 启动动子的 载载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为为模板， 以 含有标记标记 的三磷酸苷为为原料，对对启动动子下游的序列进进行转转 录录，而启动动子本身并不转录转录 。如大肠肠村菌噬菌体T3，T7， SP6。 当两个不同的噬菌体转录转录 启动动子结结合在多克隆位点的 两侧侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将持粒线线 性化，在4 种三磷酸核糖核苷的相应应的噬菌体RNA聚合酶 的存在下，即转录转录 成RNA。 如反应应物中有标记标记 的三磷酸核糖核苷，所有的RNA易 被标记标记 。常用的非放射性标记标记 技术术有：生物素、地高辛（ DIG）、碱性磷酸酶（AP）、辣根过过氧化物酶（HRP）和 荧荧光素。 纯纯纯纯化：化：为为了去除在探针标记过针标记过 程中未被标记标记 的剩余 dNTP等小分子，常用乙醇沉淀法或酚/氯氯仿抽提法进进 行纯纯化。 1. 1. 乙醇沉淀法的原理乙醇沉淀法的原理：DNA可被乙醇沉淀，而未 掺掺入DNA的dNTP则则保留在上清中，由些反复乙醇沉淀 能将两者分开。 2. 2. 酚酚/ /氯氯氯氯仿抽提法：仿抽提法：交替使用酚、氯 氯仿这这两种不同 的蛋白质变质变 性剂剂，能将溶液中的蛋白质质除去。 水解：水解：RNA探针针的长长度以50-150碱基为为佳，探针针易 进进行入细细胞，杂杂交率高，杂杂交时间时间 短。合成长长的探 针针需要水解成短的探针针。 试剂试剂试剂试剂 ： 40mM NaHCO3+60mM Na2CO3 7M NH4OAc+EtoH 时间时间时间时间 ：温度：温度：6060 Lf - Lo T = K Lf Lo K= 0.11 kb/min Lf: 原检测检测 基因的长长度（已合成的探针针的长长度）kb Lo: 要水解的探针针的长长度 kb BCL-2 ISH Detection KitBCL-2 ISH Detection Kit BCLBCL2 2原位原位杂杂杂杂交交检测试剂检测试剂检测试剂检测试剂 盒使用盒使用说说说说明明书书书书 产产产产品品编编编编号号：HK1050 保存保存：置4 工作量工作量：100张张切片 有效期有效期：一年 BCL-2是主要的抗凋亡基因。本试剂试剂 盒采用针对针对 人 、大鼠、小鼠的BCL-2特异性寡核苷酸探针针，经经地高辛 标记标记 。由于采用多相寡核苷酸探针针和高敏感标记标记 技术术， 并配合使用敏感性加强型的原位检测检测 方法，具有敏感性 特别别高，背景清晰，结结果准确可靠的优优点。可以检测检测 出 常规规福尔马马林固定，石蜡包埋标标本的BCL-2 mRNA序列 。 针对针对针对针对 人的人的BCL-2BCL-2的寡核苷酸探的寡核苷酸探针针针针序列：序列： 5TGCGA CAGCT TATAA TGGAT GTACT TCATC3； 5GTGAA GGGCG TCAGG TGCAG CTGGC TGGAC3； 5AGGTG CCGGT TCAGG TACTC AGTCA TCCAC3。 上述序列和大鼠、小鼠的序列仅仅3bp/90bp不同。兔和 人序列基本相同。 适用种属适用种属: : 人、大鼠、免、小鼠组织组织 。 试剂试剂试剂试剂 盒中内容：盒中内容： 1. 胃蛋白酶（10；Pepsin）2ml； 2. 预杂预杂 交液2ml； 3. BCL-2寡核苷酸探针杂针杂 交液 2ml； 4. 封闭闭液5ml； 5. 生物素化鼠抗地高辛5ml； 6. SABC-POD 5ml； 7. 生物素化过过氧化物酶5ml。 用用户户户户自自备试剂备试剂备试剂备试剂 ：原位杂杂交专专用盖玻片（博士德有售） ：POLYLLYSINE；DEPC；20%甘油缓缓冲液 （3%柠柠檬酸，1SSC，0.5SSC, 0.2SSC, 0.5M PBS） 一、培养一、培养细细细细胞和冰胞和冰冻冻冻冻切片切片 准准备备备备工作：工作：缓缓冲液的配备备 3 3柠柠柠柠檬酸：檬酸：100ml蒸馏馏水中加柠柠檬酸（C6H8O7H2O） 3g，pH 2.0左右。 2SSC2SSC：1000ml蒸馏馏水中加氢氢化钠钠17.6g，柠柠檬酸三钠钠 （C6H5O7Na32H2O，分子量294）8.8g。 0.5SSC0.5SSC：300ml蒸馏馏水加100ml 2SSC即可。 0.2SSC0.2SSC：270ml蒸馏馏水加30ml 3SSC即可。 2020甘油：甘油：20ml甘油加80ml蒸馏馏水即可。 0.5M PBS0.5M PBS：1000ml蒸馏馏水加氯氯化钠钠30g， Na2HPO412H2O 6g，NaH2PO42H2O 0.4g，pH7.2-7.6 。 操作程序：操作程序：注意：注意：最重要的是及时时固定，并在固定液 中加入0.1的DEPC处处理，以抑制RNA酶对对mRNA的 分解作用。此外，过过度固定对对原位杂杂交有明显显的不利 影响。 1. 1. 玻片的玻片的处处处处理：理： 一般采用多聚赖赖氨酸或APES。切片 厚度20m。 2. 2. 细细胞在多聚赖赖氨酸处 处理的盖玻片上进进行培养，条件 为为37和5的CO2，所用培养基为为Dubecco基础础培养 基。细细胞长长好后0.1M PBS（pH 7.4）洗2分钟钟3次。 3. 3. 培养培养细细细细胞和冰胞和冰冻冻冻冻切片均可用下述方法固定：切片均可用下述方法固定：固定液 为为4多聚甲醛醛0.1M PBS（pH 7.2-7.4），含有1 1000 DEPC。室温固定 30