中药指纹图谱ppt课件

第五章 中药指纹图谱 Fingerprints of Chinese Materia Medica * * 1 1 同一个成药，疗效一致吗？ 中药材不同品种、产地、加工： 不同厂家： 不同工艺： 不同辅料： DateDate 2 2 DateDate 3 3 DateDate 4 4 含 量 一 致 ， 疗 效 一 致 ？ 不同厂家 银杏提取 物的色谱 指纹图谱 DateDate 5 5 Rb1+Re+Rg1: (A)0.94%; (B)0.52%;(C) 0.24%; (D) 0.03% D A Content: -Rb1 0.03%; -Re 0%; -Rg1 0% Content: -Rb1 0.03%; -Re 0%; -Rg1 0% Total:0.03%Total:0.03% Content: -Rb1 0.5%; -Re 0.16%; -Rg1 0.28% Total:0.94% 有效成分含量悬殊的人参 Great disparity among individual Ginseng roots DateDate 6 6 白芷原药材与硫熏后的药材质量比较 Serious loss of major bioactive components in Baizhi by sulfur-fumigation Process Angelicae Formosanae Radix (白芷) A: Typical sample of Bai Zhi B: Sulfur fumed sample of Bai zhi (current popular practice) The sulfur-fumigated sample showed the major coumarin contents have been destroyed seriously (lost 60% - 80%). Imporatorin Isoimporatorin 11 Oxypeucedanin 10 13 cnidilin 12 7 9 1 2 3 4 5 6 8 A B A B DateDate 7 7 Sharp contrast of crude drug and slices for decoction of Paeoniae Radix (白芍) with different contents of active glycosides respectively. 有害的饮片加工 硫熏干燥的白芍饮片活性成分大减 Active ingredients declined Baishao slices for decoction compared with the natural dried crude drug Paeoniflorin-sulphite paeoniflorin B-07-3 B-07-14 B-07-3 B-07-14 DateDate 8 8 质量相差悬殊的连翘药材 Great disparity of ingredients in different Lianqiao crude drugs 青翘老翘无籽老翘所含有效成分递减 Forsythiaside A Forsythin 1 2 3 青翘 Immature Lianqiao 老翘 mature Lianqiao 老翘（无种子） Mature Lianqiao （ without seeds) DateDate 9 9 2010版药典丹参提取物指纹图谱 原儿 茶醛 迷迭 香酸 丹酚 酸B DateDate1010 中药指纹图谱的含义（掌握） 中药经适当处理后，采用一定的 分析手段，得到的能够标示该中 药特征的共有峰的图谱。 DateDate1111 中药指纹图谱的特性（掌握） 稳定性（重现性） 整体性（模糊性） 特征性 在规定的方法与条件下，不同的操作者和 不同的实验室应能重复 能反映中药 有效部位所 含大部分成 分的种类， 或指标成分 的全部 能特征地区 分中药的真 伪与优劣 DateDate1212 指纹图谱研究的主要目的 对中药质量标准的补充和提高。 控制原料、中间体、成品的一致性 ，控制工艺，减少批间差异。 DateDate1313 相同处方，不同工艺，疗效？ DateDate1414 指纹图谱中应包含的信息 对于中药材和中药饮片：种的共性，用药 部位的共性，产地的个性，采收期、炮制 方法的个性信息。 对于半成品和中药制剂：原药材（甚至辅 料）的信息；工艺信息等。 药效信息：药效信息。 DateDate1515 二、指纹图谱研究手段 色谱技术 光谱技术 UV IR 波谱技术 MS NMR X-射线衍射法 分子生物学技术 TLC HPLC, LC/MS GC, GC/MS HPCE, CE/MS 色谱指纹图谱 DateDate1616 薄层色谱 薄层色谱薄层色谱 Thin Layer Chromatography (TLC)Thin Layer Chromatography (TLC) 可在同板同时分析多达可在同板同时分析多达1818个样品个样品 ，时效高，时效高 所用的是正相展开剂，其组成变化所用的是正相展开剂，其组成变化 灵活，可适应多种成分的分离灵活，可适应多种成分的分离 离线操作，即可直观比较图谱，又离线操作，即可直观比较图谱，又 可扫描得到轮廓图和处理数据可扫描得到轮廓图和处理数据 占机时间短占机时间短 具有色彩参数，可获得色彩丰富的具有色彩参数，可获得色彩丰富的 色谱图像，直观性强；同时辅以功能色谱图像，直观性强；同时辅以功能 团显色剂还可提示成分的类别，提高团显色剂还可提示成分的类别，提高 鉴别的专属性。鉴别的专属性。 展距局限在展距局限在 10cm10cm20cm20cm ， 柱效柱效 相相 对较低，对复杂组分不对较低，对复杂组分不 提高分离度则难以提取提高分离度则难以提取 指纹特征的药材受到限指纹特征的药材受到限 制。制。 开放系统，对环境温开放系统，对环境温 度、相对湿度要求较高度、相对湿度要求较高 Date17 TLC举例：区分不同品种 Date18 TLC举例：监控工艺 Date19 高效液相色谱 反相高效液相色谱反相高效液相色谱 (RP-HPLC)(RP-HPLC) Reversed Phase High Performance Liquid ChromatographyReversed Phase High Performance Liquid Chromatography 适用范围广适用范围广 分离性能好分离性能好 分析速度快分析速度快 流动相选择范围宽流动相选择范围宽 灵敏度高灵敏度高 色谱柱可多次重复使用色谱柱可多次重复使用 流出组分可以收集流出组分可以收集 采用多种检测器，可同时获采用多种检测器，可同时获 取保留值信息和化合物的光谱取保留值信息和化合物的光谱 、质谱信息、质谱信息 对较为复杂的色谱实对较为复杂的色谱实 验条件要求比较苛刻，由验条件要求比较苛刻，由 此带来不同实验室之间重此带来不同实验室之间重 现性的难度增大现性的难度增大 Date20 Date21 I III II 诃 子 小诃子 大诃子 绒毛诃子 诃子指纹图谱 Date22 GC HPCE 气相色谱气相色谱 Gas Chromatography (GC)Gas Chromatography (GC) 分离效能高分离效能高 分析速度快分析速度快 适用于植物适用于植物 的挥发油成分的挥发油成分 及其它易挥发及其它易挥发 性成分或可转性成分或可转 化为可挥发的化为可挥发的 成分测定成分测定 可提供保留可提供保留 值信息，与质值信息，与质 谱联用，还可谱联用，还可 提供更丰富的提供更丰富的 化学结构信息化学结构信息 分辨率高，分辨率高， 得到的色谱组得到的色谱组 份非常复杂，份非常复杂， 尤其是含挥发尤其是含挥发 油药材，单萜油药材，单萜 类成分组成很类成分组成很 不稳定，样品不稳定，样品 间差异可能很间差异可能很 大，处理数据大，处理数据 和判别相似度和判别相似度 时一定程度的时一定程度的 取舍取舍 毛细管电泳毛细管电泳 Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresis 分离效能高分离效能高 分析速度快分析速度快 高分辨率高分辨率 可与紫外、荧光、电化学、质可与紫外、荧光、电化学、质 谱、拉曼光谱等联用，可提供更谱、拉曼光谱等联用，可提供更 丰富的化学结构信息丰富的化学结构信息 Date23 肉桂油的气相色谱指纹图谱 Date24 Date25 Date26 独活GC指纹图谱 羌活GC指纹图谱 Date27 H P C E 指 纹 图 谱 DateDate2828 高效液相色谱 红外光谱红外光谱 (IR)(IR) Infrared SpectraInfrared Spectra 几乎所有的物质都有特征的几乎所有的物质都有特征的 红外光谱。红外光谱。 虽然植物中药提取物还是一虽然植物中药提取物还是一 个混合物，但是由于不同物质个混合物，但是由于不同物质 的红外光谱具有加合性，因此的红外光谱具有加合性，因此 ，植物中药提取物的红外光谱，植物中药提取物的红外光谱 能反映出所有成分的综合信息能反映出所有成分的综合信息 因而具有全息光谱的特点。因而具有全息光谱的特点。 操作简便（不需要复杂的提取操作简便（不需要复杂的提取 仪器）、快速、准确、经济、仪器）、快速、准确、经济、 溶剂低毒、重复性高、实用性溶剂低毒、重复性高、实用性 强。强。 Date29 红外光谱图 中国药典规定：小 蓟在开花时采。 根据1384cm-1处吸 收峰的有无，可以鉴 别其采集时间是否正 确。 小蓟丁酮提取物的红外 指纹图谱 DateDate3030 三、指纹图谱构建程序 中药指纹图谱 供试品溶液 10批以上中药 图谱信息 固定产地、采收期 和加工炮制的中药 中药未 知检品 预处理 不同产地、采收期 和加工炮制的中药 评价标准 药效学试验 代表性 均一性 选择测试条件 方法建立考察 测定图谱参数 图谱分析 相关性 图 谱 评 价 图谱测试、相似度评价 方法检验 Date31 一、样品收集 n最关键的步骤 真实性 代表性 n10批以上 n原药材 ：不同产地、不同采收季节等 Date32 Reference fingerprint Date33 二、供试品溶液制备 原则 1. 确保中药中的主要化学成分或有效成分在 图谱中得以体现 2. 所含成分的理化性质和检测方法 Date34 二、供试品溶液制备 1.原药材、饮片供试品溶液的制备 尽可能与生产工艺的提取溶剂接近或一致 定量操作进行 Date35 二、供试品溶液制备 2. 半成品/中间体供试品溶液的制备 参考制剂和产品制备工艺 Date36 二、供试品溶液制备 2. 中药制剂供试品溶液的制备 直接使用、稀释或溶剂提取的方式 Date37 三、对照品（参照物）溶液制备 n1. 参照物的选择 道地药材/饮片 半成品 制剂 主要活性成分或指标成分 内标物 n 2. 合适溶剂 Date38 四、指纹图谱实验研究 原则： 专属性、整体性、重现性 n试验方法 n试验条件 Date39 液相色谱液相色谱 色谱柱：比较试验加以选择色谱柱：比较试验加以选择 Date40 流动相 1 流动相 2 流动相 3 流动相：至少用三种不同组成比较流动相：至少用三种不同组成比较 Date41 适宜的柱温和检测波长适宜的柱温和检测波长 15 20 25 30 35 203 210 236 254 365 Date42 五、方法学验证 1. 稳定性试验 供试品溶液的稳定性 Date43 表3 川芎指纹图谱稳纹图谱稳 定性试验试验 相似度计计算结结果（n=5） S1 S2S3S4S5 对照指纹图谱 S11.0000.9970.9950.9950.997 0.998 S20.9971.0000.9980.9970.996 0.999 S30.9950.9981.0000.9980.991 0.999 S40.9950.9970.9981.0000.990 0.999 S50.9970.9960.9910.9901.000 0.994 对照指纹图谱0.9980.9990.9990.9990.994 1.000 Date44 五、方法学验证 3. 重复性试验 实验方法的重复性 n=5 峰面积比值 RSD 不大于3 保留时间：平均相对保留时间1min Date45 注意事项 HPLC和GC指纹图谱：记录时间一般为1小时； TLC指纹图谱：须提供从原点至溶剂前沿的图谱； 光谱方法制定指纹图谱：必须按各种光谱的相应规 定提供全谱。 对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立多张指 纹图谱。 DateDate4646 四、指纹图谱分析步骤 标定共有指纹峰，确定参照峰 非共有峰总面积不得大于总峰面积的10 计算各共有峰的相对保留时间、峰面积比 给出标准（对照）指纹图谱及数据 DateDate4747 五、指纹图谱的评价 要求“准确的辨认”而不是“精密的测量”； 比较供试品与对照品的色谱指纹图谱要求“ 相似”而不是“相同”。 评价色谱比较的结果，是根据其模糊属性， 着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨 认完整色谱的“图貌”，而不是求索细枝末节 。 DateDate4848 指纹图谱相似度评价 直观分析比较：看一看 量化数