bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测(1)

Bit1Bit1 基因在酵母双杂交系统中的表达及基因在酵母双杂交系统中的表达及 对报告基因激活作用的检测对报告基因激活作用的检测(1)(1) 作者：滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕 【关键词】凋亡；Bit1 基因；酵母菌双杂交；报告基 因 ExpressionofBit1geneinayeasttwohybridsystemandrepor tergeneactivationassay 【Abstract】AIM:ToconstructabaitvectorwithBit1genei nyeasttwohybridsystemGAL4,andassaywhetherBit1geneex pressionproductaffectsthegrowthofhostyeastcellsanda ctivatesthereportergenesintheyeasttwohybridsystem.M ETHODS:TheBit1genefragmentswereamplifiedbyRTPCRfrom ovariancellCaov3,andclonedintopUC19forDNAsequencing.A fterverifiedbyDNAsequencing,theyweresubclonedintoth ebaitvectorpGBKT7ofyeasttwohybridsystemGAL4,andther ecombinantplasmidsweresubsequentlytransferredintoye astcellAH109,anditsexpressionproductwastestedwhethe ritcouldactivatethereportergenesintheyeasttwohybrid system.RESULTS:TheBit1genefragmentsweresuccessfully amplified,andtheirexpressionproductshowedtobenontox ictoAH109cells,anddidnotactivatethereportergenesoft heGAL4system.CONCLUSION:YeasttwohybridGAL4systemcan beutilizedtostudyBit1interactingprotein. 【Keywords】apoptosis;Bit1;yeasttwohybridsystem;rep ortergenes 【摘要】目的：用 Bit1 基因片段构建酵母双杂交 诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及 对报告基因有无激活作用.方法：运用 RTPCR 技术从卵巢癌 细胞系 Caov3 中扩增出 Bit1 基因片段，克隆入 pUC19 质粒， 经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体 pGBKT7 中， 将重组质粒导入酵母菌 AH109，检测其表达产物在酵母细胞 中对报告基因有无激活作用.结果:成功获得 Bit1 基因片段， Bit1 基因表达的蛋白对酵母菌 AH109 无毒性，对报告基因 亦无激活作用.结论：可以利用酵母双杂交 Gal4 系统来研 究与 Bit1 相互作用的蛋白. 【关键词】凋亡；Bit1 基因；酵母菌双杂交；报告基 因 【中图号】R737 0 引言 酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相 互作用的方法，具有灵敏度高和特异性好的优点.自 1989 年由 Fields 等1提出并初步建立以来，得到了不断的 完善和改进，在细胞生物学，肿瘤学，蛋白质组学等诸多 领域有着广泛的应用2-3.Jan 等4在研究 bcl2 转录 调控的实验中，发现了一种可下调 bcl2 表达的新基因，并 因其功能而命名为 Bit1（bcl2inhibitoroftranscription1）.研究表明，胞 浆内 Bit1 浓度的升高可以明显促进凋亡的发生，而其浓度 的降低可以减少凋亡的发生.我们拟利用酵母双杂交 GAL4 系统，构建 Bit1 蛋白即诱饵蛋白，以期从人脑 cDNA 文库 中钓取可与之结合的蛋白基因，为研究细胞凋亡的发生和 调节提供新的思路和实验依据. 1 材料和方法 材料卵巢癌细胞系 Caov3 购自中国医科大学细胞生物 研究所，表达载体 pGBKT7 及酵母菌种 AH109 购自 Clontech 公司.质粒 pUC19 由第四军医大学生物化学与分子生物学教 研室张伟博士惠赠.逆转录酶购自 Promega 公司；PCR 试剂 盒，DNA 重组所用的限制性内切酶购自 Takara 公司；T4DNA 连接酶购自 Gibco 公司；质粒提取试剂盒，DNA 电泳胶回收 试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自 Clontech 公司. 方法 扩增 Bit1 基因自行设计出克隆 Bit1 基因的引物.常规 培养 Caov3 细胞，提取细胞总 RNA,加入下游引物和逆转录 酶，45各作用 30min 进行逆转录,反应条件为：70 10min,4245min,955min.再取逆转录产物加入引物 P1 和 P2 扩增 Bit1 基因.PCR 反应条件为：9430s,61 45s，7250s，共进行 38 个循环. 产物克隆及鉴定纯化的 RTPCR 产物经 EcoR和 BamH 双酶切，定向克隆入 pUC19 质粒，转化大肠杆菌 DH5，进 行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为 pUC19Bit1，然后进行序列分析. 构建及鉴定诱饵载体用 EcoR和 BamH酶切 pUC19Bit1 和表达载体 pGBKT7，回收 Bit1 基因及 pGBKT7 载体片段，载体片段与 Bit1 基因连接后转化大肠杆菌 DH5.经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为 pGBKT7Bit1. 制备酵母感受态细胞随机挑取几个酵母菌 AH109 克隆， 接种于 50mLYPDA 液体培养基中，振荡培养至 A600=在室 温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再 离心取沉淀，用 mL1TE/LiAc 溶液重悬，即为酵母感受态 细胞. 转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精 DNA 和酵母感受态细胞，混匀后加入 mLPEG/LiAc 溶液.在 30 振荡培养,加入 DMSO 后混匀,在 42水浴 15min,冰浴 2min, 离心,去上清，以 mL1TE 重悬细胞后，铺于 SD/Trp 平板. 于 30培养 36h 左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出. 和 LacZ 报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母 菌单个克隆，分别划线于有 Trp，Ura，His，Leu 营养缺陷 的 SD 平板上，于 30培养 36h，观察酵母菌的生长情况. 采用 半乳糖苷酶印膜法检测 lacZ 报告基因的表达.用无 菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上. 将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻 5s 后，置于室温 裂菌.将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有 Zbuffer/Xgal 的 Whatman#1 滤纸上，去气泡，于 30孵育 30min8h，观察颜色变化. 2 结果 基因的扩增采用优化的逆转录方法对人卵巢癌细胞系 Caov3 总 RNA 进行逆转录，然后在 50L 反应体系中继续扩 增反应.取 RTPCR 扩增产物 10L，在 10g/L 琼脂糖凝胶中 电泳，可见与预期大小一致的 600bp 左右的 DNA 片段（图 1）. 重组质粒 pUC19Bit1 的酶切鉴定及测序用 EcoR和 BamH双酶切 pUC19 质粒及 PCR 产物，回收 pUC19 载体片 段及 Bit1 蛋白基因片段，连接后获得的重组质粒命名为 pUC19Bit1.再用 EcoR和 BamH对 pUC