pi-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究(1)

PI-103PI-103 对多药耐药白血病细胞体外作用对多药耐药白血病细胞体外作用 的研究的研究(1)(1) 【摘要】 目的 研究 PI-103 对耐药白血病细胞的效果及 其机制。方法 四甲基偶氮唑蓝（MTT）法研究 PI-103 对 K562 及 K562/A02 细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞内 阿霉素浓度的改变。结果 PI-103 能显著抑制两种细胞株 的生长，对敏感和耐药白血病细胞株具有相同的抑制效果； PI-103 能显著增加细胞内阿霉素的浓度，与阿霉素联用时， 能增加阿霉素对细胞的生长抑制作用，但仅有叠加效应而 无协同效应。结论 PI-103 对于耐药白血病是一种有良好 应用前景的药物。 【关键词】 白血病 多药耐药 PI-103 多药耐药是急性白血病治疗失败的主要原因，其主要机 制是 P-糖蛋白（Pgp）高表达，将细胞内的化疗药物“泵” 出细胞外，导致细胞内药物浓度过低，使白血病细胞呈现 出耐药表型。如何绕过 Pgp 的泵作用，逆转耐药，提高白 血病的治疗效果是当前治疗的重要方向。K562/A02 是由 K562 细胞经长期阿霉素诱导和克隆筛选而建立的一个耐药 细胞系1，能在 2g/ml 阿霉素中长期生存，对阿霉素的 耐药指数在 10 以上。它高表达 Pgp，是体外研究多药耐药 的一个较好的细胞模型。 PI-103 是一种人工合成的 PI3K 和 mTOR 特异性抑制剂。 PI3K 和 mTOR 是 PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径的重要成员， 该信号途径在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。近年 来发现 PI-103 对黑色素瘤2、肺癌3、神经肿瘤4等 多种肿瘤具有抑制作用，显示了较好的抗肿瘤效果。本研 究旨在研究它对多药耐药白血病细胞株 K562/A02 的作用。 1 材料和方法 细胞株及培养条件 K562 及 K562/A02 细胞株由浙江大 学医学院第一附属医院血液病研究所传代保存。培养基为 含 10%胎牛血清的 RPMI1640（Gibco 公司产品） ，置 37、 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，K562/A02 长期以 2g/ml 阿霉素（ADM）加压培养，在实验前 2 周撤除阿霉素。取对 数生长期的细胞进行实验。PI-103 购自美国 cayman 公司。 法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，调整细胞浓度， 以 1105 个细胞/ml 的终浓度接种于 96 孔培养板，加入不 同浓度药物，空白对照组以培养基补足，每孔总体系，CO2 孵箱内培养 24 小时（h） ，加 MTT 工作液 20l/孔（美国 Sigma 公司） ，置 CO2 培养箱中孵育 4h，1000 rpm/min 离心， 小心吸去上清，加入二甲基亚砜/孔，吹打，使紫蓝色甲臜 沉淀充分溶解。在酶标仪 570nm 波长处读取吸光度值（A） 。 以时间为横轴，A 值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复 三次，设复孔三个，取平均值为最终结果。按下列公式计 算细胞增殖率： 细胞生存率=（A 处理组-A 空白组）/（A 对照组-A 空白 组）*100% 细胞生长抑制率=1-细胞生存率 流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度：将 M 的 PI-103 和/或 2g/ml 阿霉素与终浓度为 1105/ml 的细胞共同孵 育 24 小时，收集 15105 个细胞，1000rpm 离心 5min， 弃上清。加入适量冷 PBS，细胞重悬，1000rpm 离心 5min， 重复 2 次。以冷 PBS 重悬细胞，上机行流式细胞检测。流 式检测激发波长 488nm，接收波长 575nm。细胞内阿霉素浓 度高低以荧光强度为计量单位。 统计学处理 采用 t 检验，所有数据经统计软件分析。 2 结果 PI-103 对敏感和耐药细胞株的生长抑制作用相同 我们用 MTT 法检测了不同浓度 PI-103 对 K562 及 K562/A02 细胞增殖的抑制作用。M 的 PI-103 处理 24h 后， 两种细胞均呈现出明显的细胞生长受抑。而且，细胞的生 长抑制呈现出剂量依赖性。此外，在相同浓度的 PI-103 作 用下，两种细胞株的生长抑制率基本相同，差异无统计学 意义（P)。 PI-103 能增加白血病细胞株对阿霉素的敏感性，但仅 有叠加作用 为进一步了解 PI-103 与阿霉素是否具有协同抑制白血 病细胞增殖作用，我们用 M PI-103 与不同浓度阿霉素联 合作用于 K562 细胞及 K562/A02 细胞，以 MTT 法观察了药 物联用对两细胞的生长抑制效果。结果显示，M PI-103 对 K562 及 K562/A02 细胞的抑制率分别为%和%，加用 PI- 103 后，阿霉素对 K562 细胞的抑制率有所增加，但单用阿 霉素组的生长抑制曲线与联用 PI-103 组的生长抑制曲线几 乎平行，说明 PI-103 联用阿霉素仅有叠加作用，而无协调 作用。同样，在 K562/A02 组，但单用阿霉素组的生长抑制 曲线与联用 PI-103 组的生长抑制曲线几乎平行。说明 PI- 103 联用阿霉素对 K562/A02 细胞生长抑制作用也仅有叠加 作用，而无协同作用。 PI-103 能增加耐药细胞株细胞内阿霉素的浓度 为明确 PI-103 增加细胞对阿霉素敏感性的机制，本实 验采用用流式细胞术检测了细胞内阿霉素的浓度。 结果显示，在 K562 组，未用 PI-103 时，细胞内阿霉素荧 光强度为，PI-103 处理后，细胞内荧光强度升高为， 差异具有统计学意义（P=） 。而在 K562/A02 组，PI-103 使 细胞内阿霉素荧光强度由升高至，差异具有显著统计 学意义（P=） 。结果显示 PI-103 能显著增加细胞内阿霉素 的浓度，尤其是在耐药 K562/A02 细胞中更明显。 3 讨论 PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径是细胞生存和增殖的重要 途径，在白血病多药耐药的形成机制中也发挥了重要作用。 因而，通过抑制 PI3K 途径诱导细胞凋亡达到治疗白血病尤 其是耐药白血病的目的是一个较好的治疗思路5。本研究 结果显示，双向抑制剂 PI-103 能显著抑制白血病细胞的增 殖，且不受耐药细胞表型的影响，在耐药细胞及不耐药细 胞中发挥同样的抑制生长作用。PI3K/AKT/mTOR 信号转导途 径抑制剂是一种有良好应用前景的药物。 本研究发现，在 Pgp 高表达的细胞株 K562/A02 中，PI- 103 能明显提高细胞内阿霉素的浓度，其增加量明显高于敏 感株 K562。其机制可能是由于 Pgp 的合成受抑制导致的。 Ta