hcv非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析(1)

HCVHCV 非结构蛋白非结构蛋白 3 3 反式激活基因反式激活基因 6 6 转染转染 肝癌细胞的基因表达谱芯片分析肝癌细胞的基因表达谱芯片分析(1)(1) 作者：邵清，成军，王琳，张健，卢成哲 【关键词】 丙型肝炎病毒 ScreeningofgenesdifferentiallyexpressedinHepG2cells transfectedwithHCVNS3TP6bymicroarrayassay 【Abstract】AIM:Tostudythedifferenceingeneexpressio ninhumanhepatoblastomacelllineHepG2cellstransfected withHCVNS3TP6expressingplasmidandtofurtherelucidate itsmolecularbiologicalmechanism.METHODS:Sequencespe cificprimersweredesignedandsynthesizedandtheNS3TP6c odingDNAfragmentwasamplifiedwithpolymerasechainreac tiontechniqueusingpBRTM3011plasmidcontainingthefull lengthofHCVHcDNAasthetemplate.Theexpressionvectorof wasconstructedbyroutinemolecularbiologicalmethods.c DNAmicroarraytechnologywasemployedtodetectthemRNAfr omtheHepG2cellstransfectedrespectivelywithandusingl ipofectamine.RESULTS:Theexpressionvectorwasconstruc tedandconfirmedbyrestrictionenzymedigestionandDNAse quencinganalysis.TheexpressionofNS3TP6proteinwascon firmedbyWesternblothybridizationwithsinglechainvari ableregionantibody.HighqualitymRNAandcDNAwereprepar edandsuccessfulmicroarrayscreeningwasconducted.Thes canningresultsindicatedthatamongthe1152geneswhichwe reobtainedfromgeneexpressionprofileanalysis,45wered ifferent,ofwhich7geneswereupregulatedand38geneswere downregulatedinNS3TP6expressingHepG2cells.CONCLUSIO N:cDNAmicroarraytechnologyissuccessfullyusedtoscree nthegenesdifferentiallyexpressedinNS3TP6expressingH epG2cells,whichbringssomenewcluesforthestudyofthemo lecularmechanisminvolvedintheHCVinfectionandhepatoc ellularcarcinomadevelopmentinducedbyHCVNS3TP6protei n. 【Keywords】 hepatitisCvirus；NS3protein；cDNAmicroarray 【摘要】目的:为了研究 NS3TP6 可能的分子生物学功 能，我们应用基因芯片技术，检测丙型肝炎病毒非结构蛋 白 3 反式激活基因 NS3TP6 的表达对肝母细胞瘤细胞 HepG2 基因表达谱的影响.方法：以分子生物学技术构建 NS3TP6 的真核表达载体，以表达质粒转染 HepG2 细胞，以空载体 为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取 mRNA.应用基 因表达谱芯片技术对差异表达 mRNA 进行检测和分析.结果： HepG2 细胞经转染 NS3TP6 后，有 7 条基因表达增强，38 条 基因表达降低.结论：应用基因表达谱芯片成功筛选了 NS3TP6 的反式调节基因，为进一步阐明 NS3TP6 的反式激活 作用及免疫调节机制提供了新的依据. 【关键词】丙型肝炎病毒；非结构蛋白 3；基因芯片 0 引言 丙型肝炎病毒（HCV）感染具有很大的危害性1,2. HCV 非结构蛋白 3（NS3）基因编码的 NS3 蛋白（631aa）是 一种多功能蛋白质，在 HCV 复制及表达产物多蛋白裂解加 工上起重要作用3 ，在 HCV 致病（癌）过程中也起着重 要的作用，研究其作用分子生物学机制有助于理解 HCV 感 染的慢性化和致癌作用机制.我们克隆了 NS3 蛋白反式激活 作用的新靶基因，即 HCVNS3 蛋白反式激活基因 6（NS3TP6） 4.为进一步了解 NS3TP6 蛋白可能的分子生物学功能， 我们应用基因芯片技术，检测 HCVNS3 反式激活基因 NS3TP6 的表达对肝母细胞瘤细胞 HepG2 基因表达谱的影响. 1 材料和方法 材料 HepG2 细胞及感受态大肠杆菌 JM109 为本室保存；真核 表达载体购自 Invitrogen 公司；LipofectaminePLUS 转染 试剂购自 Gibco 公司，mRNA 提纯试剂盒为 AmershamPharmacia 公司产品；PCRSelectcDNASubtraction 试剂盒，50PCREnzymeMix，AdvantagePCRCloning 试剂盒 购自 Clontech 公司；HighPurePCRProductPurification 试 剂盒购自 BoehringerMannheim 公司；T7，SP6 通用引物及 pGEMTeasy 载体为 Promega 公司产品.cDNA 的基因芯片由上 海联合基因有限公司提供. 方法 构建 NS3TP6 蛋白真核表达质粒，用 LipofectaminePLUS 转染试剂将 2g 及空载体分别转染 35mm 平皿 HepG2 细胞，48h 后收获细胞.使用 mRNAPurification 试剂盒，直接提取转染了 NS3TP6 表达质 粒及空载体的 HepG2 细胞 mRNA，经琼脂糖凝胶电泳及分光 光度计进行定性、定量分析.参照 Schena 等的方法逆转录 标记 cDNA 探针并纯化.Cy3dUTP 标记对照组细胞 mRNA（5g） ，Cy5dUTP 标记实验组细胞 mRNA（5g）.乙 醇沉淀后，溶解于 20L 的含 g/LSDS 和 5SSC 的杂交液 中.包含的 1152 个 cDNA 的基因芯片，包括原癌基因和抑癌 基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关 基因、信号转导相关基因等.以通用引物进行 PCR 扩增， PCR 产物长度为 10003000bp.靶基因以 g/L 溶解于 3SSC 溶液中，用 Cartesian 公司的 Cartesian7500 点样仪及 TeleChem 公司的硅烷化玻片进行点样.玻片经水合（2h） 、 室温干燥（h） ，紫外线（UV）交联，再分别用 g/LSDS、水 及 g/L 的硼氢化钠溶液处理 10min，晾干备用.将基因芯片 和杂交探针在 95水浴变性 5min，将混合探针加在基因芯 片上，置于 60杂交 1517h.依次以 2SSCg/LSDS,SSCg/LSDS,SSC 洗涤 10min，室温晾干. 用 GeneralScanning 公司的 ScanArray3000 扫描芯片.用预 先选定的内参照基因（24 条管家基因，每个基因点 2 个点， 共 48 个点）对 Cy3 和 Cy5 的原始提取信号进行均衡和修正.用 软件分析 Cy3,Cy5 两种荧光信号的强度，计算 Cy5/Cy3 比 值.阳性结果判断：Cy5/Cy3，红色荧光，显示表达增强； Cy5/Cy3，为绿色荧光，显示表达减弱. 2 结果 总 RNA 的吸光度 A260nmA280nm，热稳定实验 70 保温 1h 与-201h 电泳条带比较，显示 28S 条带无明显降 解，电泳结果证实已抽提高纯度的总 RNA.mRNA 主要集中 于kb 的连续条带.在基因芯片的扫描分析中，如果荧光染 料的 Cy5/Cy3 比值在以上，就判断为 HCVNS3TP6 蛋白的上 调基因.共发现有 7 种基因的表达水平上调，其中包括 1 种 未知功能基因（Tab1