分子寄生虫病旋毛虫课件

旋毛虫病 旋毛虫病（trichinosis）是由旋毛线 虫（Trichinella spiralis）引起的人畜共 患的寄生虫病，流行于哺乳类动物间， 人因生吃或半熟食含旋毛虫包囊的猪肉 等而感染。 1、成虫： 细长，线状，前细后粗 2.幼虫囊包： 梭形，与肌肉纤维平行， 10.42mm大小 雌：34mm， 雄：1.41.6mm 内含12条盘曲幼虫 幼虫 旋毛虫肌内包囊 二、 生活史 生活史特点： 1. 成虫、幼虫同在一宿主体内，无需体外发 育（生物源性线虫） 2. 人因吞食幼虫 囊 包 而受感染（经口） 3. 有多种保虫宿主 人可作为终宿主和中间宿主 How Does Trichinella spiralis Make Itself at Home? secreted tyvelosylated proteins of the larva play a central role. These proteins are always present in the intracellular niche of the larva from Day 7 after infection and may be responsible for redirecting host genomic expression, leading to nurse cell formation. n(a) Loss of muscle proteins (eg. actin, myosin and creatine kinase). No muscle contractile proteins can be detected beyond Day 8 after the parasite invades the muscle cell. n(b) Enlargement and division of nurse cell nuclei during nurse cell formation. Enlargement of nuclei occurs maximally on Day 8 after the larva invades the muscle cell and nuclei remain enlarged thereafter. Nuclear division and DNA replication occurs during the first 45 days after the larva invades the muscle cell, resulting in 4N DNA in each nucleus and approximately 40 60 nuclei per nurse cell. n(c) Mitochondrial damage (ie.vacuolization of inner mitochondrial matrix). Mitochondrial damage can be detected throughout the infection period beginning on Day 5 after invasion of the muscle cell by the larva. n(d) Collagen type IV synthesis. Synthesis of mRNA begins on Day 7, while collagen protein is detected first on Day 11 after the larva invades the muscle cell. Synthesis of collagen protein ceases on Day 26. n(e) Collagen type VI synthesis. Synthesis of mRNA begins on Day 7 after the larva infects the muscle cell and continues at a low level throughout the infection period. n(f) Vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA synthesis. Synthesis begins on Day 78 after the larva invades the muscle cell and continues throughout the infection period. n(g) VEGF peptide synthesis. Synthesis begins on Day 8 after the larva invades the muscle cell and continues throughout the infection period. n(h) Secretion of tyvelosylated proteins. Secretion of tyvelosylated proteins begins on Day 7 after the larva invades the muscle cell and continues throughout the infection period. 侵入肠粘膜、水肿、出血、溃疡 肠炎和全身中毒症状，类似中毒和感冒 移行期（23周）： 高热、全身肌肉酸疼（腓肠肌尤甚 ） 3%因并发症而死亡 囊包形成期（416周） 除疼痛外，症状渐消退。 侵入期（1周内）： 侵入血管、肌肉等 1. 询问病史： 有无吃生肉 2. 病原诊断： 肌肉活检 检查吃剩肉品 3. 免疫诊断： 皮试 ELISA、IEST等 五、动物检疫 宰前检疫：ELISA 宰后检疫：幼虫、包囊 压片法 肌肉组织消化法 膈肌脚、舌、咬肌、腹肌 全球分布。北美、欧洲严重 ，感染率与食肉习惯有关 我国四川、西藏、云南、 河南、东北等曾流行 与吃生或半生的肉类有关 六、流行 我国旋毛虫病的分布 治疗：丙硫咪唑为首选治疗药物 预防：卫生教育，不吃生或半生肉类 ，加强肉类检疫，捕杀保虫宿主 七、防治 八、旋毛虫基因组学 1、研究背景 人类基因组计划（Human Genome Project ，HGP）于1990年正式启动，其主要目标有 ：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）； 测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这 些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析 工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法 律和社会问题。 n经过多国科学家的共同努力，1999年11月23 日，美国国家科学院的官员和参加人类基 因 组计划的科学家们庆祝人类基因组计划公众 DNA测序工作完成第10亿个碱基对的测定。 12月1日，一个由英、美、日等国科学家组成 的研究小组宣布，他们已经破译了人类第22 对染色体中所有（545个）与蛋白质合成有关 的基因序列，这是人类首次了解了一条完整的 人类染色体的结构，它可能使人们找到多种治 疗疾病的新方法。 n研究显示，第22对染色体与免疫系统、 先天性心脏病、精神分裂、智力迟钝和 白血病以及多种癌症相关。完成对第22 对染色体的测定将对这些疾病的早期诊 断和治疗起到帮助作用。这一成果是宏 大的人类基因组计划的一个里程碑。 n我国在1993年启动了相关研究项目，近 两年又在上海和北京相继成立了国家人 类基因组南、北两个中心。1 999年7月 ，我国在国际人类基因组注册，承担了 其中1的测序任务，此举标志着我国已 掌握生命科学领域中最前沿的大片段基 因组测序技术，在结构基因组学中占了 一席之地。 n2000年 6月26日 各国科学家公布了人 类基因组工作草图。 2001年2月，人 类基因组计划、美国塞莱拉遗传信息公 司、美国科学杂志和英国自然 杂志联合宣布，继科学家2000年绘制成 功人类基因组工作框架图之后，他们又 绘制出了更加准确、清晰、完整的人类 基因组图谱，对人类基因的面貌有了新 的发现。 2、旋毛虫基因组序列测定 nThe National Human Genome Research Institute (NHGRI) selected 18 new eukaryotic organisms to be sequenced during the year 2004 (NIH News Release). nNine mammals: Orangutan, Elephant, Cat, Rabbit , Lamprey , guinea pig , European hedgehog , lesser hedgehog tenrec, European common shrew 地鼠. nNine non-mammalian : neach of which represents a position on the evolutionary timeline marked by important changes in animal anatomy, physiology, development or behavior. nThe organisms are a slime mold (Physarum polycephalum), a ciliate (Oxytricha trifallax), a choanoflagellate (Monosiga ovata), a placozoan (Trichoplax adhaerens), a cnidarian (Hydra magnipapillata), a snail (Biomphalaria glabrata), two roundworms (Pristionchus pacificu, Trichinella spiralis) and the sea lamprey (Petromyzon marinus). nThe sequencing will be carried out by five centers in the NHGRI-supported large- scale sequencing research network: Agencourt Bioscience; Baylor College of Medicine; the Broad Institute of MIT and Harvard; The Institute for Genomic Research; and the Washington University School of Medicine. 3、旋毛虫表达序列标签研究 nEST是长约100-500bp的基因表达序 列片段。 nEST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载 体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克 隆，对其5或3端进行测序，所获序列与基因数据 库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、 繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过 程认识的技术。 n旋毛虫表达序列标签 n旋毛虫表达序列标签的研究正在进行， 该项目由华盛顿大学医学院主持。 n目前公布25314 个旋毛虫EST n2006-11 10 000 n2009-02 25 334 nMakedonka等对10130个 旋毛虫表达序列标签进行 了分析，将序列相似的 EST分成5958个contigs， 然后再对contigs进行同源 性分析，得到3454个 clusters，最后去除EST中 相同的小片段序列得到 3262个基因。将这3262 个基因其和线虫基因库（ NemaGene）进行比较， 发现44%的EST和已知的 线虫基因无同源性。 n旋毛虫在不同发育 阶段所表达的蛋白 代表了该蛋白的不 同功能，通过对旋 毛虫成虫、肌肉幼 虫、新生幼虫的 EST表达文库分析 发现，87%的基因 具有期特异性（即 基因只在旋毛虫的 某一阶段表达）。 4、旋毛虫线粒体基因 n16,656 bp ncontains the 37 genes typical of metazoan mtDNAs nincluding a putative atp8, which is absent from all other nematode mtDNAs examined nmtDNA amplification and sequencing: Total DNA from 10,000 larvae of the nematode T. spiralis n Conserved primers designed to amplify portions of cox3, cob, nad5, and nad1. nTrichi-cox3-F1, 5-TACGTAGAATACCACACATCCAC-3; nTrichi-cox3-R1, 5-ATTCTTCCGTTTACTCCTCTCGA-3; nTrichi-cob-F1, 5-CAATCCATTAGGTACACACTCAC-3; nTrichi-cob-R1, 5-CCTGTAATTCTGTATCCTCCTCA-3; nTrichi-nad5-F1, 5-TTGGTAGTTGTGGTGGGTAAGTC-3; nTrichi-nad5-R1, 5-AACAACACCACCAACCTGAGCAC-3; nTrichi-nad1-F1, 5-CACTAGCACTTACCATTCCAGCC-3; nTrichi-nad1-R1, 5-GGTTGTTGCTAGGTTGTATGAGTC-3. 九、旋毛虫分子分类 分类地位明确的7 个种 n分别是旋毛虫( T. spiralis ,T1) n北方旋毛虫(乡土旋毛虫或固有旋毛虫, T. nativa ,T2) n布氏旋毛虫( T. britovi , T3) n伪旋毛虫( T. pseudospiralis , T4) n米氏旋毛虫( T. murrelli , T5) n南方旋毛虫(纳氏旋毛虫, T. nelsoni , T7) n巴布亚旋毛虫( T. papuae , T10) 1、限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP n原理：不同种或同种不同基因型的旋毛虫DNA序列有所不同,核 酸内切酶从不同的位点切割DNA 产生不同的酶切片段,电泳后形 成限制性酶切片段多态性图谱。 n方法：常选用适当的DNA 探针通过Southern 印迹杂交,比较不同 种和地理株之间重复DNA 的RFLP 差异,从而反映出基因序列的差 异。 n1985 年,Curran 等首先应用该方法发现旋毛虫(T1) 和伪旋毛虫(T4) 的基因组DNA 存在有明显差异。 n1986 年,Klassen 等用类似方法,发现了旋毛虫的猪分 离株(T1) 、北极狐和北极熊分离株(T2) 、豹熊分离 株(T6) 与T4之间的差别。 n1991 ，Zarlenga 等研制了T5 特异性重复性DNA 序 列探针pUPB317 并用于检测印地安那州和伊利诺斯 州的野生动物旋毛虫分离株,发现当地的主要虫种为 T5 而非T1。 n1994， La Rosa 等将应用鸟枪法制备的探针用于筛 选含有T1、T2、T3 及T8 重复序列的特异性克隆。 2、随机扩增多态性 Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD n用单一的一段随机核苷酸序列作引物,可在一个或多个 位点与基因组DNA 结合,由于不同物种基因组中与引 物相匹配的碱基序列的空间位置和数目不同,所以扩增 产物的大小和数目不同,这些差异可通过凝胶电泳显示 出来。 nBandi 等用RAPD 技术鉴定旋毛虫的8 个种或基因型， 结果与同工酶方法结论相一致。 3、裂解片段长度多态性 Cleavage Fragment