分枝杆菌医学

分枝杆菌 林 徽 因 李嘉诚 汪涵 哈佛李冰冰 李 冰 冰 俞敏洪 概 述 分枝杆菌属（Mycobacterium） 是一类细长、直或略带弯曲专 性需氧性杆菌。无动力、无牙 胞、细胞壁含有大量脂质，该 菌一般认为革兰染色阳性。多 数细菌在生长的一定时期抵抗 酸-醇（acid-alcohol-fast）， 故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus） 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB） n 简称结核杆菌 n人和动物结核病的病原菌 第一节 结核分枝杆菌复合群 三个时期： 1882年结核菌被发现之前，称之为“白色瘟 疫” 1882-1945年，发现结核杆菌到抗结核药物没有 广泛应用前。 1945年以后，进入现代化学疗法阶段 1882年3月24日 世界著名的科学 家德国的 Robert Koch在 柏林发现并证实 结核杆菌是结核 病的病原体。 流行病学 全球疫情 1/3感染 新发900万/年 300万/年死亡 我国疫情 5.5亿感染者 估算有450万病人 新发145万/年 65万/年传染 13万/年死亡 特点 1.细胞壁含有大量的脂类 2.菌体不易着色，不易脱色，故采用抗酸染色、又称抗酸杆菌 3.无特殊结构，也不产生内外毒素。 4.所致感染多为慢性过程 n 结核分枝杆菌复合群（MTBC）包括 人结核分枝杆菌（M.tuberculosis） 牛分枝杆菌（M.bovis） 非洲分枝杆菌（M.africanum） 坎纳分枝杆菌（M.canettii） 田鼠分枝杆菌(M.microti)等 n前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高 一、分 类 流动人口的剧增 耐多药结核菌的 出现 人类免疫缺陷病 毒的蔓延 二、临床意义 WHO :世界仍处于 结核病严重威胁之中 生物学性状 1.形态染色：菌体细长微弯曲，有分枝，排列不规则，单个散在。易发生L 型抗酸染色阳性 2.培养特性： 专性需氧，最适温度375-10%CO2可促进生长 营养要求高，罗氏培养基（蛋黄、甘油、天门冬素、马铃薯、无机盐、 孔雀绿） 生长缓慢，18小时分裂一次，2-4周形成R型菌落，“菜花样菌落”，乳白 色干燥不透明，表面呈颗粒结节，边缘不整。 3.抵抗力：含大量脂质，抵抗力强抗干燥、抗酸碱、抗化学消毒剂、对湿 热和紫外线敏感 4.变异性：结核杆菌易发生菌落形态（L型）、毒力（BCG）、免疫原性和 耐药性变异。 致病性 一.致病物质 1.脂质：磷脂能促进使单核细胞增生，引起结核结节和干酪样坏死； 分枝菌酸与菌体的抗酸性有关； 梭状因子能破坏线粒体膜，抑制白细胞游走，引起慢性肉芽 肿 ； 蜡质D能激发机体的型变态反应；硫酸脑苷脂能抑制吞噬与溶酶 体的结合 2.蛋白质：诱发变态反应 3.多糖：与蜡质D结合能引起局部病灶的细胞浸润 4分枝杆菌生长素：脂溶性的铁熬合物 二.所致疾病： 1：原发感染：多见于儿童。常有肺门淋巴结大、干酪样坏死和结核结节 的形成，也可经血到达多个脏器引起相应结核病。 2继发感染：多见于成人或较大的儿童，也以肺部多见，特点为病灶局限 ，不易累积邻近淋巴结，病灶常钙化而愈，也可破溃成空洞。 三、免疫性 1.免疫机理：传染性免疫，主要是细胞免疫 2.免疫与变态反应：T细胞介导的结果 n结核菌素试验（OT）： 原理：细胞免疫或变态反应。 方法：用OT或PPD所做的皮内试验 结果：阳性5mm红肿硬结直径2cm强阳性红肿硬结直径2cm； 阴性红肿硬结直径5mm 意义：阳性：已感染过结核，但不一定有结核病；强阳性：可能有活 动性结核病；阴性：未感染过结核，应排除感染初期或免疫力下降 微生物学检验 （一）基本特性 n 结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒 素及侵袭性酶 n致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖 引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成 分引起的免疫损伤有关 n结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂 质和蛋白质 三、微生物学检验 （二）标本采集 n据感染部位的不同采集不同的标本 n疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检 n疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10 15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通 常需35份标本） n采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无 菌注射器抽取送检 n其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌 试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取 凝块作涂片或接种培养 三、微生物学检验 （三）标本直接检查 1.形态学检查 （1）直接涂片染色镜检 （2）浓缩集菌涂片检查法 2. 核酸检测 形态学检查 n齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique） 是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆 菌呈红色，背景呈蓝色 形态学检查 n用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下 菌体呈橘黄色 涂片镜检的报告方式 半定量报报告 石炭酸复红红染色：抗 酸杆菌（1000） 荧荧光染色：抗酸 杆菌 （450） 未找到抗酸菌 可疑抗酸杆菌； 再送标标本检测检测 0 12/300视视野 0 12/70视视野 119/100视视野218/50视视野 219/10视视野436/10视视野 319/视视野436/视视野 49/视视野36/视视野 n用PCR法快速诊断MTB感染 nPCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高 nPCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现 假性结果 核酸检测 三、微生物学检验 （四）分离培养与鉴定 1.培养特性 n专性需氧 n35CO2能促进其生长 n营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘 油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生 长良好。常用罗氏培养基 n最适生长温度为3537，最适pH6.56.8 n1418h分裂1次，在固体培养基上25周才 出现肉眼可见的菌落 n典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样 2.分离培养 n标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所 含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长) n37，510CO2培养8周 n结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落 n涂片染色为抗酸阳性 Bactec TB 960快速培养系统 3D-120型 三、微生物学检验 （四）分离培养与鉴定 3. 菌种鉴定 (1) 生化反应 （2）噬菌体鉴定法 （3）分子生物法菌种鉴定 (4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸 生化反应-烦琐、费时（ 48 周）,影响因素多 n结核分枝杆菌不发酵糖类 n能产生触酶 n人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受 噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 n人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无 毒株则为阴性，并失去索状生长现象 噬菌体鉴定法（PhaB） n Wilson 等于1997年建立的快速检测新技 术 n原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分 枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加 入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不 受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并 将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随 后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板 上出现透亮的噬菌斑。 分子生物法菌种鉴定 nPCR 限制性片段长度多态性分析（PCR- RFLP） nPCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP） n核酸探针 n核酸序列分析 n多重PCR 高效液相色谱（HPLC） n检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细 胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检 测分枝菌酸可鉴定菌种。 三、微生物学检验 （五） 免疫学诊断 1结核菌素试验 2结核分枝杆菌抗原检测 3. 结核分枝杆菌抗体检测 4. 全血干扰素测定法 结核菌素试验 n针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD)两种菌体蛋白 n原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染 结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性 结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏 反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。 结核分枝杆菌抗原检测 n用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌 抗原-结核菌外分泌特异性抗原 (external secreted specific antigen) 浓度。 n任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和 各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋 白抗原。 结核抗体 n作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一 n比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便 、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。 n近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体 抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘 露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏 度和特异性均有所提高。 全血干扰素测定法 n原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同 孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-，通过检测 IFN-的含量来鉴定菌种。 n2004年，Quantiferon-TB Gold assay 问世，应用 结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT ）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检 测。 n近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性 结核病，准确、灵敏、特异、快速。 n结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。 （六）药物敏感性试验 n将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体 培养基上，同时做不含药物的对照组。 n经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照 组的75以上，则认为该菌对该药物浓度为完全 耐药，如无菌落生长则为敏感。 三、微生物检验 第二节 非结核分枝杆菌 一、概述与分类 二、临床意义 三、微生物学检验 一、概述与分类 非结核分枝杆菌（ontuberculosis Mycobactericum，NTM） : 指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分 枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和田鼠分 枝杆菌) 和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。 nNTM种类众多，现已被鉴定的有150余种, 包括专性寄生菌、腐生菌和中间型。 n国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）分为 三类，即缓慢生长菌、快速生长菌和不能 培养菌三种类型。 nRunyon按细菌产色素和生长速度将临床重 要分枝杆菌分为Runyon、群 概 述 Runyon 分类法 群光产色菌,如猿猴分枝杆菌、堪萨斯分枝杆 菌、海分枝杆菌; 群暗产色菌,如苏加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆 菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌; 群不产色菌,如鸟分枝杆菌复合群(M1avium complex ,MAC) 、玛尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌 、溃疡分枝杆菌、嗜血分枝杆菌; 群快生长菌,如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌 、脓肿分枝杆菌。 二、临床意义 n迄今为止已发现NTM有150余种，其中约 1/3与人类疾病有关。 条件致病菌 毒力低于结结核分枝杆菌 自然界中广泛存在 可以在人体某些部位定植 n结核病和NTM感染的治疗不同 为何要关注NTM？ 自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶， 可导导致免疫力低下的患者感染。 近年来，因手术术器械、注射器具及医疗疗用水 等灭灭菌不合格、使用不规规范造成患者手术术切 口、注射部位NTM感染暴发发事件。 如：广东省某中心卫生院剖宫 产患者手术切口感染事件。 该事件是由于手术器械灭菌不 合格导致的手术切口感染，病 原菌为快速生长型分枝杆菌。 警钟长鸣NTM潜在杀手？ 卫生部关于严重医院感染事件通报 1. 关于深圳市某医院发生严重医院感染事件的通报 2. 卫生部关于安徽省某立医院恶性医疗损害事件的通报 3. 关于西安交通大学医学院某医院发生严重医院感染事件的通报 4. 关于山西省太原某中心医院血液透析感染事件的通报 5. 关于天津市蓟县某院新生儿医院感染事件的通报 6. 卫生部关于安徽省某县医院血液透析患者感染丙肝事件的通报 7. 关于广东省汕头市潮阳区某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件的 通报 摘自江苏省卫生厅严重医院感染事件通报与处罚规定选编（ 2010年7月） 光产色分枝杆菌（Runyon 群） n堪萨斯分枝杆菌（M.kansaii）：能引起肺内和肺外类似 结核样的病变 n海分枝杆菌(M.marinum)：存在于淡水或海水。除可引 起冷血动物（如鱼）感染外，亦能引起人的感染。通过皮 肤微小创口侵入皮肤而引起所谓的“游泳池肉芽肿”。渔业 工人可经受损皮肤遭受感染 n猿分枝杆菌（M.simiae）：首先从猿分离到此菌，形态 同结核分枝杆菌，可感染人类 暗产色分枝杆菌（Runyon 群） n瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum）：可引 起人的淋巴结炎或肺部感染。 n斯氏分枝杆菌(M.szulgai)：可引起成人肺 部的慢性感染。 不产色分枝杆菌（Runyon 群） n鸟-胞内分枝杆菌复合体 (M.avium- intracellulare complex,MAC or MAIC)：鸟分 枝杆菌和胞内分枝杆菌有许多相似之处，故合起 来称之为MAC。近年来发现HIV感染和AIDS患 者易感染MAC。 n 溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）：对人可通过创 伤局部感染，常在四肢伸侧形成无痛性溃疡，叫 做Buruli溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。 n蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）：是蟾蜍肉芽肿的病 原菌，对人则多引起老年男性的慢性肺部感染。 快速生长分枝杆菌（Runyon 群） n偶发分枝杆菌（M.fortuitum）：可引起人的局部感染 或肺部感染，对现有的抗结核药物均耐药。 n龟分枝杆菌（M.chelonei）：该菌在引起免疫力低下 患者感染的快速生长非结核分枝杆菌中最常见，外伤引起 的软组织病变及手术后继发感染，亦可引起肺部感染。 n 脓肿分枝杆菌（M.abscessus）：以前曾作为龟分枝 杆菌脓肿亚种。常存在于自来水中，引起注射后医院感染 的暴发。该菌也可散发引起丰胸术后、中心静脉插管、动 脉插管以及透析导管所致的菌血症。另外，该菌可导致： 近90%由快速生长分枝杆菌引起的肺部感染，外伤后感 染以及超过90%鼓膜切开管植入术后耳炎。与龟分枝杆 菌相似，该菌引起免疫力缺陷患者播散性皮下感染。 脓肿分枝杆菌引起的注射后感染 脓肿分枝杆菌引起的注射后感染 脓肿分枝杆菌引起的注射后感染 难于愈合的伤口 潮湿治疗室曾导致肌肉注射感染 n表现： 1998年4月1日5月31日共手术292例，4月22日7月14日发生切口 感染166例。潜伏期为2030天。切口部位开始为小结节，继而化脓成窦道 ，有线头挟出。清创换药后创面清洁但不愈合，或愈合后又复发，并有淋 巴结炎倾向。 n调查：20份切口分泌物标本培养出龟分枝杆菌（脓肿亚型）。医院环境和 无菌物品细菌学检查合格。使用中和未启用的戊二醛半小时不能杀灭金葡 菌、1小时不能杀灭龟分枝杆菌，测浓度为0.137%。 n结论：戊二醛浓度错配导致手术器械分枝杆菌污染，从而引起切口感染。 某医院手术切口分枝杆菌感染暴发 （广东深圳，1998） 深圳孕妇感染事件开庭： 46人索赔20002000多万元多万元 肌注部位偶发分枝杆菌感染暴发 （福建南平，1998） n表现： 1998年8月11月某诊所59例患者发生肌注部位感染，潜伏期280 天。起初肌注无明显不适，少数针孔持续疼痛，多数在洗澡或接通知后抚 摸发现注射处肿块长期不消。15天约长0.51.0cm，后期硬块出现波动感 ，压痛明显，出现水样脓液。继发腹股沟淋巴结炎4例。脓液或病理标本43 份中33份检出偶发分枝杆菌。 n调查：检查27种药物、一次性注射器和输液器均合格；其他诊所肌注者无 发病；诊所卫生条件差，1个水龙头，自来水直接从河中抽取，未消毒；玻 璃注射器15枝，煮沸消毒，时间凭经验，每天消毒1次；患者多时使用同种 药物者换针头不换注射器。 n结论：污染注射器是引起感染暴发的主要原因，细菌则可能来自河水。 （一）标本采集 见结核杆菌部分 （二）涂片抗酸染色 本菌为抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而 粗，大小约18m0.30.5m，抗酸 染色着色均匀，呈束状或团状排列 （三）分离培养与鉴定 三、微生物学检验 （三）分离培养与鉴定 光产色分枝杆菌（Runyon 群） n菌落特点是在暗处一般不产生或仅产生少量色素， 光照1h后能在48h内转为黄色或橘黄色 n需在营养复杂的培养基上才能生长，生长缓慢，菌 落光滑 n有时可形成索状生长 三、微生物学检验 （三）分离培养与鉴定 （2）暗产色分枝杆菌（Runyon 群） n无论有光或无光均能产生色素，呈黄色或 橘黄色 n生长缓慢，菌落为光滑型 三、微生物学检验 （三）分离培养与鉴定 不产色分枝杆菌（Runyon 群） n缺乏-胡萝卜素，故在光照和暗处均不能 产生色素 三、微生物学检验 （三）分离培养与鉴定 快速生长分枝杆菌（Runyon 群） n在普通培养基上即可生长 n最适生长温度为2545 n生长速度快，36d即可形成菌落 三、微生物学检验 微需氧培养4天 三、微生物学检验 （四）其他鉴定方法 nNTM非培养方法的鉴定与结核分枝杆菌类似 ，可参考结核杆菌部分。 nNTM的实验室诊断可跟据细菌生长速度、色 素等表型特征进行初步鉴定，再进行分子 诊断，后者应用越来越广泛。 第三节 麻风分枝杆菌 麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传 染病，主要表现为皮肤、黏膜和神经末梢 的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形 成肉芽肿。 根据临床表现、免疫病理变化和细菌 检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型和 界限类综合征等三种病型。 麻风分枝杆菌（M.leprae） n麻风病的病原菌 n1873年挪威学者Armauer Hansen从麻风 患者皮肤结节中发现，又名Hansen杆菌。 n革兰染色阳性 n具有抗酸性 一、临床意义 nWHO自1995年始对麻风患者实施免费治 疗 n麻