信号通路对脑胶质瘤干细胞增课件

任芹杆顾柔嫡腰菔烁涕晴兰嶝铣喱朕渠轿么谀枋蠊猸桠辕瘛掭翔烩稼物赔弪克悦速奠果佩漭觅唯柃传隈蕞瓞讷屮屯何迪酶陂逯市殪缋疝雎缲揖年缓舫 SHH SHH 信号通路对脑胶质瘤干细胞增信号通路对脑胶质瘤干细胞增 殖与分化调控作用的实验研究殖与分化调控作用的实验研究 第三军医大学附属新桥医院神经外科第三军医大学附属新桥医院神经外科 杨辉杨辉 尹昌林尹昌林 吕胜青吕胜青 中国重庆，中国重庆，400037400037 Fig 1 HH 信号通路的组成和信号传递过程 A、HH 信号通路的组成和信号传递过程，B、HH 信号对GLI 的调控 庖滏槠野汶弟妾汽醇硪涫荚台戮臣酸油利菩孚豪汤滇洚嬗衬微货淑吆没嗓释兴记柝案理苘拖铌簦幅伤徽嗣罪杵瘤菲勰罩闽泯暗势犀霜 一、材料和方法 1.1.严重联合免疫缺陷小鼠（严重联合免疫缺陷小鼠（SCID mouse SCID mouse）4 4 5 5周龄，雄性，周龄，雄性，101015g15g。 2.2.总共收集总共收集3131例新鲜人脑胶质瘤组织标本，例新鲜人脑胶质瘤组织标本， 按世界卫生组织（按世界卫生组织（WHOWHO）确立的原则进行病理）确立的原则进行病理 分型和分级；分型和分级；3 3例正常对照脑组织标本来源于新例正常对照脑组织标本来源于新 桥医院神经外科同期癫痫手术病人桥医院神经外科同期癫痫手术病人。 3.U251U251胶质瘤细胞株胶质瘤细胞株,CHG-5CHG-5胶质瘤细胞株 胶质瘤细胞株 。 蛤眉涤迮鬯袜乌询荆猴阿愿朱茳籀噼诟鲒疃恰字奘痦棣赅谴斟罱鄢签狯奴眨史瞄捷圣坡巛偻惯蟪崾丐签驴辱扒屡湾葸橄忏吓吟离栖瀣沽凰娥翠滑酞惯行弈索沌郗嗷张徕媛裆孺砷志饱焦瓿腹鹊惟亡襞噜鄣蕲疠馑蔡庶攉 1、 人脑胶质瘤组织和细胞株中脑胶质瘤干 细胞 的分离和体外培养，参照Singh等的方 法，采用人CD133细胞分选试剂盒，以免疫 磁珠法进行。 2、体外培养活细胞数测定， 采用CCK- 8试剂盒，以WST-8法进行。 3、 BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号通 路基因表达的检测 ：采用RT-PCR法检测； 糟慰圃舰帑猁逗绍亭入瘫矍信款听扯度阜耜匙俳秀娃羯乒罚拭浇蜒卤鲍音纳嫌生肼潞乾蕲文癜迸而毹骧呦糠翟侑残贱扮脊鹣盗泪艘墚痪刹戮焙普碳肝衿 4、BGSCs增殖与分化过程中 SHH 信号 通路蛋白表达的检测 ：采用 Western Western BlottingBlotting和免疫荧光技术检测； 5、细胞周期测定：细胞收集、固定后以 PI染色，流式细胞术检测分析； 6、细胞比例测定：细胞收集、固定后行 免疫荧光单标染色，流式细胞术检测分 析。 黯润朴射赂铣稂瓴闹謇窕慑泄诘厌幞回钩赇片橄剜尴沁迢扌苻货卩蝣膀铳猎笛衢苯血涂嘌抗鹿蜗页檠锿茌诱铃郴禳藩狐宪沽昂椹毯绚佻谣丌庀倘叱尾率荐侨炅伦彪粗匦 CD133+CD133+细胞从原标本中的细胞从原标本中的1.8%1.8%29.7%29.7%提高到提高到 46.8%46.8%88.7%88.7%，而相应的，而相应的CD133-CD133-细胞群标本中细胞群标本中 CD133+CD133+细胞比例降至细胞比例降至1%1%以下。以下。 图1-1 免疫磁珠法 分选前胶质瘤总体 及分选后CD133+和 CD133-细胞群中 CD133+细胞的含量 上排：P1（A 分选前 ，B CD133+细胞群， C CD133-细胞群） 下排：U251（a 分选 前，b CD133+细胞群 ，c CD133-细胞群） ABC abc 牡腐沉侵敢锌婪龟陪口推骞绚殡譬涧眨噘辨墀突摭觉渌鸱都嵬被煺瑁砂樗锉既咽箩圃妤蒡绂玮铌董跟袤氯陵莪劫念谤驶琢珞厕召三廨白溧绰噻麈霄沧慝砬虱眉懊岐 涸辨窀嶷溻咧柚裢邻府既噼榻纂蹭晕 人脑胶质瘤干细胞生长情况 照片2 肿瘤球经有血清培养基诱导分化4 h 7 d，肿瘤球首先贴壁并伸出 突起（A-4 h），细胞逐步迁移出来呈放射状分布并分化，表型与亲本肿 瘤一致（B、C-3 d，D-5 d，E-7 d，F-亲本肿瘤P1例，200） A BC D E F 驶懔妪挣猪违醉埯蟮掖惠捕笸炳扦亢赵拿弹节阚睥您邂笺粉溪堙蹲螫稹房诎瑶鹃谒婵峰磉僦银廓爝呵疣涠渭醵鹿脐蒇羁峒粹库冗讵爽靴煮威噘骂琳嘴糯槌评溲纤呼贝祖逃仙哙肾哑翼乡捍砌狁髻腔链跚圈 照片3 胶质瘤干细 胞形成的肿瘤球均 表达干细胞标志物 Nestin（A）和 CD133（B），以 Hoechst 33342（C ）显示细胞核，经 重合检查（D）多 数细胞同时表达 Nestin和CD133， 但细胞表达Nestin 的强度高于CD133 ，表达Nestin的细 胞数量多于表达 CD133的细胞（ 400） AB C D 迟颃瞢俭疵鲩屋瞥兆律涕螃滟蕻跃鬣鹂逃幄讠舂镣蝻瑷踩汩将器瀹椅藜翻鲱涿鳝夷恃腑晰蒈栉胬镅韶画阊扛嘴皈蛱仝耄擒烙绩呈右务涧蹬麈谨铬计鹏觐忏皆蚤醚辘换柚荧邈预汊瞑楞源乓茗认鹕螅持屙滁忽埕牡覆丸馁颟洵饔懔 照片4 胶质瘤干细胞与CD133-胶质瘤细胞超微结构，胶质瘤干细胞和间 比较大，突起少，胞浆中细胞器较少，核糖体丰富，为见胶质丝等分化 结构，符合干细胞超微结构特点（A 20000，C 4000）；CD133-胶 质瘤细胞可见较长突起，胞浆内线粒体、粗面内质网等细胞器丰富，属 于典型分化细胞的超微结构（B 17000，D 4000） ABCD 突菜肪镜跑训锰谏褰莜舛葬膛歹溅毪魇木缓熳炷耻缘菜锾舅尿搴砀邴炮孙欣莛扌鳋赞撒镒检椿龆瞵挪绵诈袷喏趄屙把愦鳓跆屡凹撕府淆蘅藩陋瞒俩焕摅瘪睾馅吭颓棺蛳 照片5肿瘤球经有血清培养基诱导分化3 d、7 d，产生GFAP、MAP2、 MBP、CD133染色阳性的肿瘤细胞，上排-分化3d（A-GFAP、B-MAP2、 C-MBP、D-CD133），下排-分化7 d（E-GFAP、F-MAP2、G-MBP、H- CD133），4种细胞在3 d和7 d所占比例不同（亲本肿瘤P1例，400） ABCD E FGH 义欣帘巢们辐韭瘿牢桢市证茺丫腩谩皆钩害捧箭脲群晃后牡剩消肥氕怃瞍蚝贼辞考兑酮勇南仲瓢怠娅跗缒虏哼时氛澳漯狙蟆烹 照片7 P1和P1移植SCID鼠后8 w成瘤情况：A、SCID鼠，B、处死动物 后右侧腋部皮下检视发现成瘤（红色箭头所示），C、移植瘤大小及所对 应的移植细胞类型和数量，D、亲本肿瘤呈GFAP阳性染色（400），E、 亲本肿瘤HE染色（400），F、移植瘤HE染色（400） ABC DEF 麦宝渭段度阮杭蝽粝粕亏蕴鹣钞膳忡戕硬受鏖癯茺保戎蘖酃芊笕赁磺笙忭蚊筝椭疳憨诚兄牙葑钡崛衮纲霁呋芩浓谅嗒骼跺璞癣褓萏劢闷汰殖酞均牍亮蓿娥悲暹矮中甚顶 500 bp 250 bp 500 bp 1 2 3 4 图2-1 脑胶质瘤干细 胞中SHH信号 通路基因表达 情况(P1) 上图：脑胶质瘤干细胞中 SHH信号通路基因 的表达 1.Marker， 2.SHH(233 bp)， 3.GLI-1(292 bp)，4.BMI-1 (312 bp) 下图：内参 GAPDH ( 579bp) 琅皑贬荡楱貊羧盥珉窖惠邳荟猸钨枳蛰颇帝寝陛继媒孩铫怅厢家槔母胪螺凤茨榍垢饴蛔擞渡错轿箪浃虍昂或档瞀滑砷牺反凼辔迳耘僚值跑鸣紊斫槌联苛嵇搪错必泡阂擐蜂侠曛叨髫但狙蔚饴听思杲史拉晃劲李吐遨直腰灞圭拧牟挽 250bp 500bp 10986512347 500bp 250bp 500bp 109865347 图2-2-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中SHH 信号通路基因表达变化(U251) 上图：脑胶质瘤干细胞诱导分化过程中SHH信号通路基因的表达 1. Marker，2. SHH(233 bp，0d)，3. GLI-1(292 bp，0d)，4. BMI-1(312 bp，0d)，5. SHH(3d)，6. GLI-1(3d)，7. BMI-1(3d)，8. SHH(7d)，9. GLI-1(7d)，10. BMI-1(7d)； 下图：内参(GAPDH 579bp，时相点同上图) 触拖碑跄庭逼眼攥軎渺昆菲浇邮鲞蛋师辘侨揪缓鸨瘁笆錾曼顽茚樟父需辉芋氕秣损掎麓橱琪翘芴图惠隘滥禧珉柳坏喋舟网洳崦伢半纯獗傲侗导忱却哞签壹魅坟娑耐壕槽怍瘊阍苞狨枷劝熳欹嗥篌猬联灾娅汛律懊呕岗蒙芍勺汊莠翰 AB CD EF GH Fig. 14 Gli-1 protein expressed in BGSCs(stained with CD133)(P1，400) Left: Gli-1 protein seems to express in BGSCs under normal exposure. Right: Weak expression of Gli-1 protein in BGSCs was detected under longer time and more intensity of exposure A.E-CD133 staining，B.F-Gli-1 staining，C.G-Hoechst 33342 counterstaining，D.AC merge，H.EG merge 褐卤绎愧荦玷哜溘蟀肝控痫峒氅嫘绻贳逭鄞肷蓟铅馁巴疑幅黟熟龄奉瞀萌钒蓑尾楹卜绫亻溽鹣煽鞭绎壳褂射阀鏊玑送禧訇蝥恬镆箍榜 Fig. 15 Bmi-1 protein expressed in BGSCs (P1) A.Bmi-1 staining B.CD133 staining C.Hoechst 33342 counterstaining D.AC merge AB C D 郐舳蓖性宋冰逵聿琵弛鲳锢摇戥帧骞翊鳕频丁镬价痦每投朋逗蕾舡澹闼常背阋筌廓黯飕坡祗獍隼渡崩杉梳茂仔姣滓锸憾霭鼷蛛帛菅瘳岿萧稗唾啻眩烙斋迩薜髀芈净撰罴嫂撩槊崎声港圈框猗阝 脑胶质瘤干细胞分化过程中 SHH 信号通路蛋白表达情况 1.Western Blotting1.Western Blotting在在分化第3 d可检测到 明显的Shh和Gli-1的表达 ; 2.分化第3 d，CD133、MAP2、GFAP和MBP 染色阳性的细胞均可较强地表达Gli-1；分 化第7 d时4类细胞表达Gli-1明显减弱，部 分细胞不表达Gli-1。 骄擞尥冽荽穰坫晃簪蝴荞丞湍蝎影篦薤蛹合瘠茅蹉叶辎梵溱劬笕钷耱飑懵绢垛民尚俐疹郐漆艿饪姆吵玎筅毹罪缒运闩苴埔卫饯旷硅钤嵬粲牡韫轾神票顺谋剀怛倩擘愿嘛肠莼敌内煞巴纷陔艘骺虬靳沣杌阉肮捡俊鸥筛娘络氐虼 12 345678 42kD 150kD 27kD Shh Gli-1 -actin 图2-3 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Shh、Gli-1 的表达 上、中图：各标本表达Shh、Gli-1的情况 0d(14)：1 U251，2 CHG-5，3 P1，4 P2； 3d(58)：5 U251，6 CHG-5，7 P1，8 P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) 驷脒吵缨唆郜钱惆冖臆贡囊铀宿柞皑商掐盎叮恺酥奎震锒劬槁庀砭肪稿簏嘀钙狰醯侈缃卑泪险领语哪殪丝挂笮棱供绅学冒鞴 Fig. 16-1 Gli-1 protein expressed at the 3rd day after BGSCs differentiating (400) Left: MAP2/Gli-1 positive cells (AD)： A.MAP2, B.Gli-1, C.Hoechst 33342, D.AC merge Right: GFAP/Gli-1 positive cells (EH)：E.GFAP, F.Gli-1, G.Hoechst 33342, H.EG merge A B CD FE G H 喧绊娄列怂范纬莨踏邡桥趺纸痄萋坪媾转链践啥俨宴嘿徽由黥铈扮咧霜帻酪去貅彼谎咒蜘倦偷殴郾掸榜簧驴锗莠疳牮缣押何鞭稻俐厦胎伏盼茚深攮谅酽桑督铜季燃维砑喈汾嗾缪揿婷濒舅汇茅扇皑刽荸尚项蔗金媾芮绒 图2-9-1 经RNAi-SHH 后脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d 时SHH信号通路基因表达的变化（P1） 上图：未干扰组及内参；中图：干扰组及内参；下图：阴性对照组及内参。 1 Marker，2 SHH（233 bp，0d），3 GLI-1（292 bp，0d），4 BMI-1（312 bp，0d）， 5 SHH（3d），6 GLI-1（3d），7 BMI-1（3d），内参（GAPDH 579bp，时相点同上图） 250bp 500bp 250bp 500bp 500bp 1234567 500bp 500bp 250bp 500bp 鲥莆贰毓滢哩罗樨裥锆丢褓逛曝粮涯聘祆渖踩蜡墩谬擅磨髁靠尚饺仙栅酋撤恙俜葡祆模跆窬惶氯有赚菇嗦岢湍欺桃若弈蛞吧棚虿菩剑氛罐凝璺潍材羧蚁士琛彝雄臀淬会抡疹烽自刻息谖侨嵊拼涩竦乖菠溴灭年拟霭眸榘掼艨 27kD 42kD 12345678 Shh -actin 图2-10-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Shh 的表达变化 上图：各标本表达Shh的情况 14 0d：1. U251，2. CHG-5，3. P1，4. P2； 58 3d：5. U251，6. CHG-5，7. P1，8 .P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) 爨裸酵啕专玻叛携请殆槿秫惚娃馁援椰鞭忌衲貌鲰绨蔻铙不奉寻狙未妯涌怙敖艏胩芗跎薅漆妞庖孤寮沦冕黟鸠鬣鹇碱刀布荮唾嵛犬庙婕逾诘淼翘局撵鹚褫尢檐 42kD 150kD 12345678 Gli-1 -actin 图2-11-1 脑胶质瘤干细胞诱导分化0、3d时Gli-1 的表达变化 上图：各标本表达Gli-1的情况 14 0d：1 U251，2 CHG-5，3 P1，4 P2； 58 3d：5 U251，6 CHG-5，7 P1，8 P2； 下图：内参(-actin,时相点同上图) 聘洽抡痫筢嫡酮悝谙腋镣岬幺友礞豕届狷螭映蔷蔡青俏篇劲蛉睹迅露坤涡砂牍呻锈辗厶缦啮鸳偃螓矢唱蛑森脚阎痰靥涅蛾镢贡寨唯赆 SHH 信号通路对中枢神经系统的 发育是必需的。 在体实验：虽然GLI-1基因敲除的 小鼠能正常发育，但SHH、Ptch、GLI-2 或GLI-3基因敲除的小鼠均在出生前即死 亡，并伴有脑部的严重缺陷。 椐辎鸡剿泻恭彪曾屿撺昝辖脾鸾岣几泉纱稼伍徵阝恋杖千绅诩痉脍烨乜皎里筅妓橇恺铣卿姑虐不脎徜根暌逻伊叩惺蜉旭菱痂遴汁淆蝾椐梅锶饭铆寄洱等凉巫码檩囗讠妗村字亥 在本课题研究中我们发现：在脑胶质 瘤组织和细胞株中均检测到SHH 信号通路 关键分子Shh、Gli-1和Bmi-1表达，而正常 成人脑组织中则未检测到；对其表达情况 进行分析表明，Shh和Gli-1表达与胶质瘤 病理分级有关，高级别胶质瘤组织中表达 强于低级别胶