医学课件血液凝固调节系统

血液凝固调节系统 上海第二医科大学 瑞金临床医学院 胡翊群 对血液凝固系统的调节，使其改变凝血性质，减 少纤维蛋白的形成、降低各种凝血因子的活化水平 就是抗血液凝固作用。与此作用相关的生理性物质 组成了抗血液凝固系统。在其中应该包括血管内皮 细胞合成分泌抗凝物质、光滑内皮阻止血小板活化 和纤维蛋白的沉积的抗凝作用，以及单核-巨噬细胞 对活化凝血因子消除作用的抗凝功能体现。但这种 细胞承担的抗凝作用机制不明，目前的检测技术不 足以说明细胞抗凝能与生理性抗凝蛋白作用相比。 因此，本节主要阐述血液中生理抗凝蛋白的作用和 特性。广义上，对纤维蛋白的降解以及有关酶类对 活化凝血因子的消除都是对血液凝固的调节。因此 ，纤溶系统也可算作抗凝系统的一部分。 生理性抗凝蛋白（1） 抗凝血酶 抗凝血酶（antithrombin， AT）是主要的生理 性血浆抗凝物质，尤其对凝血酶的灭活能力占 所有抗凝蛋白的70%80%。 AT与丝氨酸蛋白酶作用的活性位点位于 Arg393-Ser394处，蛋白酶攻击该键使其裂解并 引起AT变构，从而形成AT与酶1：1复合物， 这种共价结合是不可逆的，但能被肝素或硫酸 乙酰肝素（heparan sulfate）大大加强。AT与 其他丝氨酸蛋白酶抑制物如1-AT、2-AP、 HC-II、Nexin及PAI等在氨基酸序列结构上具 有同源性。 肝素和抗凝血酶的抑酶作用 Heparin Antithrombin Thrombin 除肝以外，其他脏器如肺、脾、肾、心、肠、 脑等也有合成AT的能力，血管内皮细胞、巨核细 胞也是AT的合成场所。 AT的抑酶谱很广，除凝血酶外，它还能抑制凝 血因子Xa、IXa、Xla、XIIa以及纤溶酶、胰蛋白 酶、激肽释放酶等。作用机制都是相同的，通过 形成1：1共价复合物而灭活这些活性因子或蛋白 酶。肝素作用于AT的赖氨酸残基从而大大增强AT 的抗凝酶活性（2000倍以上）。利用培养的J82 细胞研究发现，AT -heparin可有效抑制VIIa/TF 复合物，这一作用甚至可被因子X和XI加强，已 证明这种抑制并不是由TFPI所引起的，也不需要 Xa的活性丝氨酸残基。 AT缺乏是发生静脉血栓与肺栓塞的常 见原因之一，但与动脉血栓形成关系不 大。目前对先天性AT缺乏的分子机制研 究报道很多，获得性AT缺乏一般因合成 障碍（如肝受损）或消耗过度（DIC、脓 毒血症、深静脉血栓、急性早幼粒细胞 白血病等）所致。 生理性抗凝蛋白（2） 蛋白C系统 目前认为蛋白C系统除蛋白C（protein C，PC）外，还包括蛋白S（protein S， PS）、血栓调节蛋白（thrombomodulin， TM）和内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C receptor，EPCR）。 PC由肝细胞合成，是一个依赖维生素K的蛋白质，因此与 凝血因子IX、X及凝血酶原等有很高的同源性，分子结构分 为羧基谷氨酸区（Gla区），EGF区（PC有两个EGF结构） 及含有活性位点的丝氨酸蛋白酶区段。 PS也是由肝细胞合成的依赖维生素K的蛋白质，PS是维 生素K蛋白质中碱性最大的一种。人类PS有10个羧基谷氨 酸残基（牛PS有11个），此外分子中还有1个很短的凝血酶 敏感区和4个EGF样结构。 TM是一相对分子质量为74000的单链糖蛋白，与PC分子具 有同源性，EGF区（共6个，236aa，凝血酶的结合点即位于 该区）、SerThr富含区（34aa）、跨膜区（23aa）、C端为 38aa的胞内区。已知TM存在于除脑血管外的所有血管内皮细 胞中，淋巴管内皮细胞、成骨细胞、血小板、原始巨核细胞 系及循环单核细胞中也有发现，但其合成场所目前还不能肯 定。人血及尿中还存在一种相对分子质量略低于细胞型TM的 可溶性TM。 内皮细胞蛋白C受体 自从1994首先在 内皮细胞表面发现存在一种穿膜的蛋白 受体，它可以影响活化蛋白C的活性，并 对整个蛋白C调节血液凝固作用有作用。 迄今对这种被称为EPCR的物质还不太了 解。但有几点是可以肯定的：由内皮 细胞合成；贮存于内皮细胞胞质中； 在炎性反应时可表达内皮细胞表面； 在胚胎细胞中就可检测出EPCR的基因 。 蛋白 C 的抗凝途径 Blood Flow Thrombomodulin Protein C APC 损伤处下游的抗凝作用 Thrombin Thrombin Thrombus 血管损伤处发生的血栓 EPCR VIIIai 蛋白 C 的主要抗凝作用 Blood Flow VIIIa Va Thrombus Vai APC APC PS PS Factor V Leiden Vai 蛋白C系统是微循环抗血栓形成的主要 血液凝固调节物质。蛋白C系统的活化随 着凝血酶的产生并与内皮细胞表面的血 栓调节蛋白TM形成复合物而启动。此时 ，若内皮细胞表面表达了EPCR，则可与 蛋白C结合，结合于EPCR的蛋白C可被TM 与凝血酶复合物激活，使蛋白C切下12氨 基酸的多肽。（蛋白C肽，Protein C peptide， PCP）。 生理性抗凝蛋白（3） 组织因子途径抑制物 TFPI是一单链糖蛋白，血浆含量为(54 142)g/L，均值100g/L。TFPI属于Kunitz 族丝氨酸蛋白酶抑制物，即分子中含有 Kunitz结构。这一族的典型分子是抑肽酶（ aprotinin）。除血浆中存在TFPI以外，血小 板的颗粒及溶酶体中也有TFPI，含量为 8g/L，是由巨核细胞合成的，血小板活化 后也会释放入血浆。此外，发现体内活化的 巨噬细胞可能合成TFPI。 激活的VIIa非常稳定，即使在肝素存在 时，AT对它的灭活也很缓慢。已知TFPI 是主要的调节物。TFPI可以直接抑制活 化的X（Xa），并以依赖Xa的形式在Ca2+ 存在条件下抑制TF/VIIa复合物。 TFPI对Xa的抑制通过形成1：1复合物 的形式来实现，这步不需要Ca2+参与。但 TFPI结合于Xa的活性中心，形成TFPI-Xa 后，需在Ca2+存在下与TF/VIIa形成多元 复合物。在这种结合中，Xa的富含梭 基谷氨酸区域（Gla区）是不可缺少的， 因此这是Ca2+的结合位点。 TFPI抑制谱不很广，除抑制Xa及TF/VIIa 外，还能抑制胰蛋白酶，对纤溶酶及糜 蛋白酶也有轻微抑制，但不抑制凝血酶 ，活化蛋白C、t-PA等。 组织因子途径抑制物（TFPI）与凝血 因子Xa（FXa）的机制 TFPI+FXaTFPI-FXa复合物 TF，FVIIa TFPIFXa/TFFVIIa四聚体 FXa，FVIIa被灭活 生理性抗凝蛋白（4） 蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物 PZ是一种维生素K依赖的糖蛋白，由肝脏合成分泌 后进入循环血液中。与其他维生素K依赖的因子一样 具有 Gla残基，在结构上与因子VII、IX、X和蛋白C 极为相似。华法令可使PZ水平下降到正常时的15%以 下；DIC、肝病、骨髓纤维化以及新生儿的PZ水平都 是很低的。而凝血酶可以与PZ结合也可以将PZ裂解 。 ZPI是一种丝氨酸蛋白酶，相对分子质量为72000 ，由肝脏合成分泌。与别的氨基酸蛋白酶存在25% 35%的相同构形，与大鼠的存在87%的同源性。 ZPI在血液凝固或血栓形成时会大量消耗。 在这两个调节蛋白中，较早发现有血液凝固 调节作用的是PZ。比较明确的实验是检测血浆 或者因子Xa与PZ孵育后，因子X活性会明显下 降。这种作用在磷脂和Ca2+的存在时变得更加 明显。这种现象可以解释为PZ与因子Xa在磷脂 表面存在一种反应，而这种反应的结果是使因 子Xa失活。 在以后的研究中进一步证实，ZPI在PZ的协 助下，可形成Xa-ZPI-PZ复合物而使因子Xa在1 min内失去95%以上的凝血活性。 蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物 的抗凝机制 纤维蛋白溶解系统 纤维蛋白溶解系统（fibrinolytic system） 简称纤溶系统，是指纤溶酶原经特异性激活物 使其转化为纤溶酶（plasmin，PL），以及PL 降解纤维蛋白和其它蛋白质的过程。纤溶过程 是一系列蛋白酶催化的连锁反应，是正常人体 的重要生理功能，它与血液凝固存在着既矛盾 而又统一的动态平衡关系，其主要作用是将沉 积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管畅通 ，防止血栓形成或使已形成的血栓溶解，血流 复通。 纤维蛋白溶解系统（1） 纤溶活性物质 纤溶酶原（plasminogen，PLG）是一种单链糖 蛋白，主要由肝脏合成而分泌入血。根据纤溶酶原 含糖量和结构的不同，可分为两种不同的类型。天 然纤溶酶原的N端是谷氨酸，故称为谷氨酸纤溶酶 原，它是由两条肽链组成，A链及B链，由二硫键连 接。在少量纤溶酶的作用下，在N端切去一个短肽 ，使N端为赖氨酸，称为赖氨酸纤溶酶原。赖氨酸 纤溶酶原被激活剂激活的效率极大，同时与纤维蛋 白的亲和力较高，因而能较迅速地转变为赖氨酸纤 溶酶，起到更有效的纤溶作用。 组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）t-PA主要由 内皮细胞合成和释放，单核细胞、巨核 细胞及间皮细胞也产生一定量的t-PA。 游离状态的t-PA与PLG的亲和力低，只有 在t-PA、PLG和纤维蛋白三者形成复合体 后，才能有效地激活PLG转变成PL，从而 使纤维蛋白凝块溶解。 尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator u-PA）u-PA属丝氨酸蛋白 酶，是一种单链糖蛋白。u-PA主要由泌尿生殖 系统上皮细胞产生，血中浓度为（220） ng/ml。u-PA有两种类型，未活化的单链尿激 酶常称为scu-PA（single chain urokinogen type plasminogen activator, scu-PA），已 活化的双链尿激酶称为tcu-PA（two chains urokinogen type plasminogen activator, tcu-PA）。两种u-PA 均可以直接激活PLG，不 需纤维蛋白作为辅因子，但scu-PA对纤溶系统 的激活较tcu-PA为弱。 纤溶酶（plasmin,PL）PL是由PLG经PA作用， 使PLG活化、裂解后所产生的。单链PLG在t-PA 或u-PA的作用下，在其精氨酸560-缬氨酸561 之间的肽键断裂，形成双链PL，一条为重链（ 相对分子质量为60000），另一条为轻链（相 对分子质量为25000），活性中心位于轻链部 分。PL是一种活性较强的丝氨酸蛋白酶，其主 要作用为 降解纤维蛋白原和纤维蛋白； 水解各种凝血因子（、）； 分解血浆蛋白和补体；可将单链t-PA、单 链u-PA转变为双链t-PA、u-PA；将谷氨酸 PLG转变为赖氨酸PLG；可降解GPb、 GPb/a激活转化生长因子，降解纤维连 接蛋白，TSP等各种基质蛋白质。 纤维蛋白溶解系统（2） 纤溶抑制物 纤溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1） PAI-1是一种 单链糖蛋白，含有379个氨基酸，相对分 子质量为52000，其q21-22之间，全长约 12.2Kb。PAI-1主要由血管内皮细胞和血 小板合成，正常人血浆中浓度为5 85g/L。它主要作用是与u-PA或t-PA结 合形成不稳定的复合物，使它们失去活 性，其次也可抑制凝血酶Fa、Fa、K 和APC的活性。 纤溶酶原激活抑制物-2（plasminogen activator inhibitor，PAI-2） PAI-2是一种糖蛋 白，含有415个氨基酸，其基因位于18 q21-23 ，基因全长16.5Kb。PAI-2最早是从人胎盘中 提取的，其它如白细胞、单核细胞、巨噬细胞 也能合成PAI-2。正常人血浆中浓度极低， 5g/L。妇女妊娠期间逐渐升高，分娩后1周 降至检测不到水平。PAI-2有两种类型，一种 为非糖基化型（低相对分子质量型），相对分 子质量为46000；另一种为糖基化型（高相对 分子质量型），相对分子质量为70000。PAI-2 的主要作用是有效地抑制tct-PA、tcu-PA，在 正常妊娠时调节纤溶活性。 蛋白C抑制物（protein C inhibitor, PCI ） PCI是一种相对分子质量为57000的单 链糖蛋白，由肝脏合成或释放，能有效 地抑制APC，故又称为APC抑制物（ ACPI）。正常人血浆中浓度为5mg/L。 PCI能与以丝氨酸为活性中心的蛋白酶形 成1：1的复合物，使蛋白酶失活。 也有人称起为3型纤溶酶原激活抑制 物。 2-抗纤溶酶（2-antiplasmin, 2-AP） 2-AP又称2-纤溶酶抑制物（2- plasmin inhibitor, 2-PI）,是一种单链糖蛋白，含有452 个氨基酸，相对分子质量为67000。2-AP主 要由肝脏合成或释放，正常人血浆中浓度为 1mol/L。2-AP以两种形式存在于血循环中 ，一种能与PL结合，约占总2-AP的70%，另 一种为非纤溶酶结合型，无抑制功能。2-AP 的主要功能是抑制PL、凝血因子（Fa、Fa 、Fa）、胰蛋白酶、激肽释放酶等以丝氨酸 为活性中心的蛋白酶，其发挥作用的机理为： 与PL以1:1的比例形成复合物；FXIIIa使2 -AP以共价键与纤维蛋白结合，减弱纤维蛋白 对PL作用敏感性。 2-巨球蛋白（2-macroglobulin, 2 -MG） 2-MG是一种二聚体糖蛋白，由 两个完全相同的亚基所组成，总相对分 子质量为725000。每个亚基含有1451个 氨基酸。2-MG主要由肝脏和巨噬细胞 产生，正常血浆中浓度为25mol/L。 2-MG有两个功能区，易裂区（bait region）和硫醇酯区，是一种广谱的蛋白 酶抑制物，可与PL结合形成复合物而使 PL灭活。 纤维蛋白溶解系统（3） 纤溶的作用和产物 1内激活途径 主要是通过内源凝血系统的有关因子 裂解PLG形成PL的过程。F经接触激活成为Fa， 后者使PK转变为激肽释放酶，激肽释放酶能激活 PLG为PL，此是继发时纤溶理论基础。 2外激活途径 主要是指t-PA和u-PA使PLG转变为PL 的过程，t-PA和u-PA受PAI-1及PAI-2的抑制，它们 之间的作用，激活、抑制调节着纤溶系统，此是原 发性纤溶的理论基础。 3外源性激活途径 药物依赖途径，激活纤溶系统 的制剂如SK、UK、重组t-PA注入体内，使PLG转变 成PL，此是溶栓治疗的理论基础。 纤维蛋白原的降解 PL作用于Fg，并从Fg的 B链上裂解下来一个小肽B1-42，再从A链 上裂解下来的一种极附属物（碎片A、B、C） 留下的片段称为X片段（相对分子质量250000） ，X片段继续被PL作用，裂解为D片段（相对分 子质量100000）及Y片段，Y片段再进一步被裂 解为D和E片段（相对分子质量为50000），故Fg 在PL的作用下产生降解产物，是由X、Y、D、E 、B1-42和极附属物A、B、C、H碎片组成，统 称为纤维蛋白原降解产物（FgDP）。 可溶性纤维蛋白的降解 Fg在凝血酶的 作用下，分别从A链及B链裂解下纤维 蛋白肽A（fibrin peptide A, FPA）（A1-16 ）和纤维蛋白肽B（fibrin peptide B, FPB） （B1-14），形成纤维蛋白和（可溶 性纤维蛋白单体）。Fb-在PL的作用下， 先从其B链上裂解出小肽B1-42，再从其 A链裂解出A、B、C、H极附属物，最终 形成X、Y、D和E。在PL的作用下Fb- 中B链被裂解释放出肽B15-42，然后又 从A链裂解出A、B、C、H极附属物，最 终也降解出X 、Y 、D和E 碎片。 交联性纤维蛋白的降解 Fb-和Fb- 可自行发生聚合，经因子XIIIa作用而形成 交联的纤维蛋白。后者在PL的作用下，形 成X，Y，D，E碎片外，还生成D-二聚体 和-二聚体、A链的附属物（碎片A、B 、C、H）、复合物1（DD/E），复合物2 （DY/YD）和复合物3（YY/DXD）等。这 些产物统称为纤维蛋白降解产物（fibrin degradation products, FbDP）。 Fg降解产物（FgDP）和纤维蛋白降解产 物（FbDP）统称为纤维蛋白（原）降解产 物（FDPs）。FDPs对血液凝固和血小板的 功能均有一定的影响。其中所有的碎片均 可抑制血小板的聚集和释放反应。碎片 （X）因与可溶性纤维蛋白单体结构相似， 故可与Fg竞争凝血酶，并可与FM形成复合 物，以阻止FM的交联；碎片Y（Y）和D可 抑制纤维蛋白单体的聚合，碎片E可以抑制 凝血活酶的生成；极附属物A、B、C、H可 延长APTT及凝血时间。 血液凝固调节系统检测 筛查试验 1.蛋白C Global 试验 2.活化蛋白C抵抗(APCR)试验 3.纤维蛋白降解产物(FDP)测定 4.D二聚体(DDimer)测定 5.纤溶酶原(PLG)检测 蛋白C Global试验 原理: 凝血酶（T）与血管内皮细胞表面的凝血 酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后 者使蛋白C（PC）形成活化蛋白C（APC）。 APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和 因子VIIIa，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1（ PAI-1）使纤溶活性增强。此外，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC ，使PC转化为APC，APC也受PCI的抑制 检测方法： 在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直 接激活PC转变为APC。随后加入APTT试剂以 检测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C activity-dependent clotting time，PCAT）。若 待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后血 浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的 影响，本试验设计了对照组，即在试验过程 中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活 性的血浆凝固时间（PCAT/O），其结果应短 于60秒。 参考值： PCAT为85200秒，PCAT/O为3355秒（ n234） 临床意义： 本试验多用于蛋白C、蛋白S、FV Leiden突变和FII 20210 GA突变的检测， 起到蛋白C系统筛选检测作用。 本试验也有假阳性，见于凝血因子V、VIII 活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。 123450 1 2 3 各种凝固比值 (mg/ml) APTT PT RVVT 时间 Control Factor V Leiden APCR的实验示意图 APCR 对 FVLeiden突变的筛查 APTT X seconds APTT + aPC Y seconds Y X正常 Y = X或Y X患者 血清纤维蛋白（原）降解产物检测 【原理】 胶乳凝集法：在受检血清中加入用特异性抗纤维蛋 白（原）D、E片段抗体标记的胶乳颗粒悬液，如果血清中含 有纤维蛋白（原）降解产物（FDP），特别是D、E片段，即 可发生抗原抗体反应，导致胶乳颗粒凝集。 【参考值】 血清FDP10g/ml 【临床评价】 本法具有快速、简便和可靠的优点，是国际上 最先选用的有关纤溶和DIC的检验方法。目前认为，血清FDP 的检测是诊断DIC的敏感和可靠指标之一。 1血清FDP轻度增高（1040g/ml） 常见于急性静脉 血栓、急性心肌梗死、严重肺炎、大手术后、恶性肿瘤和休 克等。 2血清FDP明显增高（40g/ml） 见于原发性纤溶 症、DIC、急性早幼粒细胞白血病及应用链激酶等溶栓治疗 时。 血浆D-二聚体检测 【原理】 血浆D-二聚体（D-dimer,D-D）检测，常用下列两种方法： 1胶乳凝集法 受检血浆中加入标有D-二聚体单抗的胶乳颗粒悬液，如果 血浆中含高于0.5mg/L的D-二聚体，便与胶乳颗粒的抗体结合，此时胶乳 颗粒发生凝集。 2ELISA法 将D-二聚体单抗包被于酶标反应板，加入受检血浆，血浆中 的D-二聚体（抗原）与包被在反应板的D-二聚体抗体结合。然后再加酶标 记的D-二聚体抗体，与包被的D-二聚体结合。最后加入底物显色，显色的 深浅与血浆中D-二聚体的含量成正相关，所测得的A值可从标准曲线中计 算出血浆中D-二聚体的含量。 【参考值】 胶乳凝集法：阴性； ELISA法：小于400g/L。 【临床评价】 D-二聚体是交联纤维蛋白降解产物之一，为继发性纤溶之特 有代谢物，可作为原发性与继发性纤溶鉴别的可靠指标，同时也可作为溶 栓治疗有效的观察指标。其中胶乳凝集法方便、快速，是临床上经常采用 的D-二聚体定性试验，而ELISA法作为具有更敏感和精确的定量试验方法 之一。 1DIC时呈阳性或明显增高，是诊断DIC的重要依据之一。此外，在深静 脉血栓、心肌梗死、