蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性课件_2

蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性 Properties of Compound Action Potentials on Toad Sciatic Nerve Trunk 陆源 浙江大学医学院 1786年Galvani所做的双金属电极 刺激蛙神经引起下肢收缩的实验 Galvani（17371798）意大利解剖医学家及物理学家 Introduction 检流计，1848年德国人发明 1850年，用检流计测得蟾蜍坐骨神经干动作电位的传导速度为2030m/s electrode 1933年美国科学家 Gasser和 Erlanger用示波器对外周神 经活动进行研究性总结，并发表了著名的论文Electric signals of Nervous Activity（1939年）。 用示波器做蛙坐骨神骨干动作电位实验 阴极射线示波器，1922年美国人发明。 细胞外记录（ Extracellular Recording）实验阶段 剑桥大学Hodgkin和Huxley应用金属微电极 对乌贼巨神经纤维电活动 进行系统研究， Hodgkin和 Katz提出离子假说。 1949年，凌宁和Gerard 发明玻璃微电极。电压钳和膜片钳将电生理研 究推向分子水平。 用玻璃微电极做细胞电生理实验 尖端直径0.5m 的玻璃微电极 细胞内记录（ intracellular Recording）实验阶段 目的（objective） 测定蟾蜍坐骨神经干复合动作电 位（compound action potential ，CAP） ，研究蟾蜍 坐骨神经干的特性、双相动作电位形成机制及神经损 伤、药物对神经兴奋传导的影响。 1.材料和方法 (Materials and methods ) 1.1实验动物（laboratory animal) 蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种， Zhuoshan Toad） 雄性蟾蜍皮肤光滑，前肢趾上有黑色婚垫，会鸣叫。雌性蟾蜍皮肤 粗糙，无婚垫，不会鸣叫。 婚垫 雄蟾 雄蟾 雌蟾 1.材料和方法 (Materials and methods ) 1.2药品(drug) 任氏液、2%普鲁卡因、3Mol 氯化钾 任氏液由无机盐和蒸馏水配置而成，每升 溶液含NaCl 6.5g、KCl 0.14g、CaCl2 0.12g,、NaHCO3 0.20g、NaH2PO4 0.01g。 任氏液的理化特性与蛙的组织液近似。可 用于蛙的组织、器官润湿和营养。 普鲁卡因：局部麻醉药，用于浸润 麻醉、传导麻醉等。普鲁卡因与 Na+通道内侧受体结合，使通道蛋 白质构象变化，促使Na +通道失活 状态闸门关闭。 1. 3器材( Experimental apparatus) RM6240生物信号处理系统 (RM6240 biolgical signal collecting system )（成都仪器 厂）、神经标本盒（ nerve chamber )。 RM6240C微机生物信号处理系统 RM6240微机生物信号处理系统可以同时采 集、放大、显示、记录、分析四路生物信 号及一路刺激输出，12导联心电图输入记 录，可用于人体和动物实验。仪器参数全 程控设置，有多种数据分析功能和数据转 换输出功能。 神经干标本盒。 S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+ S+、S-刺激电极，E接地电极 ，r1- 、r1+和r2- 、r2+引导电极 ， 1.4制备坐骨神经干（ preparation of sciatic nerve trunk ） 蟾蜍毁脑脊髓，去上肢和内脏，下肢剥皮浸于任氏液中。 蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎；标本腹面向上，用玻璃分针分 离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处结扎，剪断神经；将神经干从腹面移 向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟腱分离坐骨神经。坐骨神经标本 置任氏液中备用。 1.5 仪器连接和参数 (Apparatus junction and parameter) 神经 干标本盒两对引导电极分别接微机生物信号处理系统1、2通道。 仪 器参数：1、2通道时间常数0.02s、滤波频率1KHz、灵敏度5mV，采 样频率：100KHz，扫描速度：0.2ms/div。单刺激激方式，刺激幅度 1.0V，刺激波宽0.1ms，延迟2ms，同步触发。 RM6240C微机生物信号处理系统 神经干标本盒。 S+ S- E R1 - R1+ R2- R2+ 采样频率 通道模式 扫描速度 灵敏度 滤波频率 时间常数 1.6 记录动作电位( Record action potential) 神经干标本置于标 本盒的电极上，神经与电极接触良好，调节刺激电压，记录动作 电位。 神经干 标本 2.1 测定中枢端引导的双相动作电位（biphasic action potential, BAP) 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干末梢端，测定中枢端 BAP正、负向振幅(amplitude，A)和时程(duration，D） 2. 观察（observations) + - R1-R1 +R2-R2 + 中枢端引导的动作电位 Central end Peripheral end Ac1 Dc1 Ac2 Dc2 2.2 测定末梢端引导的双相动作电位 用1.0V电压，波宽0.1ms的 单个方波激刺激神经干中枢端，测定末梢端BAP正、负相振幅和时 程。 Dp1 Dp2Ap1 Ap2 Ap1 Ap2 + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end 2.3 兴奋传导速度的测定 用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺 激神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导CAP起点的时间差 t ，根据 S R1- R2- / t 计算出AP的传导速度。 S R1- R2- t = S R1- R2- t + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end 2.4 引导电极间距离与动作电位振幅和时程的关系 用1.0V电压，波 宽0.1ms的单个方波激刺激神经干中枢端，测定第1对引导电极间距为10、 20、30mm时的BAP正相振幅和时程。 A110 D110 A210 D210 要求：分别测量第1对引导电极记录的动作电位正相、负相的幅度和时程 + - R1-R1 + R 1+ 末梢端引导的动作电位 Peripheral end Central end Am Dm 条件：刺激电压1V, 刺激波宽0.1ms 2.5 测定单相动作电位（monophasic action potential，MAP） 用镊子夹 伤对1对引导电极间的神经干，然后用1.0V电压，波宽0.1ms的单个方波激 刺激神经干中枢端，测定末梢端MAP振幅和时程。 + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end Dm AmAm Dm + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end 2.6 观察刺激强度（U）与动作电位振幅的关系 刺激波宽0.1ms，刺激电 压从0.1V开始， 按步长0.05V增加，刺激电压每增加一次刺激神经干一次 ，并记录刺激电压和MAP振幅。 图 刺激强度与动作电位振幅的关系 A（mV) U(V) Maximal stimulusThreshold stimulus 要求：测定阈强度和最大刺激强度，刺激强度与动作电位振幅的关系曲线 神经干引导所获得复合动作电位（ compound action potential (CAP）与单 神经纤维引导的动作电位的性质有所不同。 2.7 测定KCl处理前后MAP振幅 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms， 记录 3 mol/L KCl 处理前，处理后5时MAP的振幅。 处理后 KCl 处理前后动作电位 处理前 Aap + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end KCl滤纸 2.8 测定 procaine 处理前后BAP振幅 刺激电压1.0V，刺激波宽 0.1ms，记录4 procain处理前，处理后5时BAP的振幅。 处理后 procaine 处理前后动作电位 处理前 + - R1-R1 +R2-R2 + Peripheral end Central end procainel滤纸 蟾蜍坐骨神经干电生理实验蟾蜍坐骨神经干电生理实验 陆源 （浙江大学医学院机能中心，浙江 杭州 310031） 摘要（abstract） 目的 研究蟾蜍坐骨神经干的生理特性及神经损伤、 药物对神经兴奋传导的影响。方法 应用微机生物信号采集处理系统测定蟾 蜍坐骨神经干复合动作电位。 结果 刺激电压1.2V，刺激波宽0.1ms时，中 枢端引导的动作电位正相和负相振幅分别为Ac1s mV和Ac2s mV， Ac1 大 于Ac2 ，两者有（或无）显著性差异（p0.05)；动作电位正相时程 Dc1s ms显著短于负相时程Dc2s ms，两者有（或无）显著性差异（p0.05)，末梢端引导的动作电位正相振幅Ap1s mV大于负相振幅Ap2s mV， 两者有（或无）显著性差异（p0.05)；动作电位正相时程 Dp1s ms显著短于负相时程Dp2s ms，两者有（或无）显著性差异（p0.05)；刺激电压1.2V，刺激波宽0.1ms，引导电极等于10mm、20mm和 30mm时，末梢端引导的动作电位正相振幅分别A110为7.85 2.11 mV、 A120 为10.08 2.26 mV、 A130为10.60 2.52 mV， 、A120 、 A130大于A110 ，有高度显著性差异（ p0.05).结论 在一定范围内神经干动作电位 振幅与刺激强度呈正相关，神经损伤、3mol KCl、procaine 阻断神经的兴奋 传导，兴奋可在神经纤维上双向传导， 引导电极间距小于动作电位波长时， 正相波和负相波叠加形成双相动作电位。 1. Materials and methods (材料和方法) 1.1实验动物（laboratory animal) 蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种，Zhuoshan Toad） 1.2药品(drug) 任氏液、2%普鲁卡因、3Mol 氯化钾。 1.3器材 (Experimental apparatus ) RM6240生物信号处理系统(RM6240 biolgical signal collecting system )（成都仪器厂）、神经标本盒（ nerve chamber )。 1.4制备坐骨神经干（ preparation of sciatic nerve trunk ）蟾蜍毁脑脊 髓，去上肢和内脏，下肢剥皮浸于任氏液中。蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上， 剪去尾椎；标本腹面向上，用玻璃分针分离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处 结扎，剪断神经；将神经干从腹面移向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟 腱分离坐骨神经。坐骨神经标本置任氏液中备用。 1.5 仪器连接和参数 (Apparatus junction and parameter) 神经干标 本盒两对引导电极分别接微机生物信号处理系统1、2通道。 仪器参数：1、2 通道时间常数0.02s、滤波频率1KHz、灵敏度5mV，采样频率：40KHz，扫描速 度：0.5ms/div。单刺激激方式，刺激幅度1.2V，刺激波宽0.1ms，延迟5ms， 同步触发。 1.6 记录动作电位( Record action potential) 神经干标本置于标本盒的电极上 ，神经与电极接触良好，调节刺激电压，记录动作电位。 2. 观察项目（observations) 2.1 测定中枢端引导的双相动作电位（biphasic action potential, BAP) 用1.2V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神经干末梢端，观察中枢端BAP正、 负向振幅(amplitude，A)和时程(duration，D） 2.2 测定末梢端引导的双相动作电位 用1.2V电压，波宽0.1ms的单个方波激 刺激神经干中枢端，测定末梢端BAP正、负相振幅和时程。 2.3 兴奋传导速度的测定 用1.2V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激 神经干中枢端，测定第1和第2对引导电极引导CAP起点的时间差t ，根据 S R1- R2- / t 计算出AP的传导速度。 2.4 引导电极间距离与动作电位振幅和时程的关系 用1.2V电压，波宽0.1ms 的单个方波激刺激神经干中枢端，测定第1对引导电极间距为10、20、30mm时 的BAP正相振幅和时程。 2.5 测定单相动作电位（monophasic action potential，MAP） 用镊子夹伤 对1对引导电极间的神经干，然后用1.2V电压，波宽0.1ms的单个方波激刺激神 经干中枢端，测定末梢端MAP振幅和时程。 2.6 观察刺激强度（U）与动作电位振幅的关系 刺激波宽0.1ms，刺激电压 从0.1V开始， 按步长0.05V增加，刺激电压每增加一次刺激神经干一次，并记 录刺激电压和MAP振幅。 2.7 测定KCl和procaine处理前后MAP振幅 刺激电压1.2V，刺激波宽0.1ms， 记录 3 mol/L KCl、 procaine处理前，处理后5时MAP的振幅。 3.1 刺激波宽0.1ms时，阈刺激Uth为0.450.08V；最大刺激Umaxs V ，刺激电压1.0V时，动作电位的传导速度为 s （m/s)见表1。 nUth (v)Umax (V) (m/s) 1 2 3 4 5 6 xs 表1 蟾蜍坐骨神经干阈刺激、最大刺激和传导速度 3.结果 （results） 3.2 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms时，中枢端引导的动作电位正相和 负相振幅分别为Ac1s mV和Ac2s mV，Ac1 大于Ac2 ，两者有（ 或无）显著性差异（p0.05)；动作电位正相时程Dc1s ms 显著短于负相时程Dc2s ms，两者有（或无）显著性差异（p0.05)，末梢端引导的动作电位正相振幅Ap1s mV大于负相振幅 Ap2s mV， 两者有（或无）显著性差异（p0.05)；动作电 位正相时程Dp1s ms显著短于负相时程Dp2s ms，两者有（或无） 显著性差异（p0.05)，见表1和图1、图2 。 3.3 刺激电压1.0V时，单相动作电位振幅Ams mV大（小)于双相动作 电位正相振幅Ap1s mV，两者有（或无）显著性差异（p0.05)；单相动作时程Dms ms显著长于双相动作电位正相Dp1s ms，两者有（或无）显著性差异（p0.05)，见图1、图2和表 2。 Ap1 Ap2 Dp1 Dp1 t 图1 蟾蜍坐骨神经干双相动作电位图2 蟾蜍坐骨神经干单相动作电位 Am Dm 表2 中 枢端引导和末梢端引导的动作电位参数 nAc1 ()Ac1 ()Dc1 ()Dc1Ap1 ()Ap2 ()Dp1 ()Dp2 ()Am ()Dm () 1 2 3 4 5 6 xs 3.3 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，引导电极等于10mm、20mm 和30mm时，末梢端引导的动作电位正相振幅分别A110为7.85 2.11 mV、 A120为10.08 2.26 mV、 A130为10.60 2.52 mV， 、 A120 、 A130大于A110 ，有高度显著性差异（ p0.05),见表3 表3 引导电极间距离与动作电位振幅和时程的关系 nA110()A120 ()A130 () A210()A220 () A230 ()D110 ()D120 ()D130 () 1 2 3 4 5 6 xs 3.5在刺激电压低于Uthreshold时，测不到动作电位；刺激电压从 Uthreshold增加至Umaximal，动作电位振幅呈曲线增长，刺激电压 高于Umaximal动作电位振幅不再增长，见图3。 A（mV) 图3 刺激强度与动作电位振幅的关系 U(V) 0.5 1.01.5 2 4 6 3.6 刺激电压1.0V， 3Mol KCl处理前，Af为？ ，处理后，Ab为 ？ 、 4. 讨论(discussion) 4.4 在两引导电极间夹伤神经，神经冲动传导被阻断，双相动作电位负 相波消失，形成一相正波，于此可见，双相动作电位是神经冲动先后通 过两个引导电极形成的，冲动通过第1个电极，形成动作电位的正相波 ，冲动通过第2个电极，形成动作电位的负相波。 4.1 刺激电压从Uth增加至Umax，神经干动作电位振幅随刺激电压增加 而增高。神经干动作电位不具有“全或无”性质。坐骨神经干为不同类 型的神经纤维组成，各个类型纤维的兴奋性水平不同1，在一个有限 的范围内神经干动作电位的大小与刺激的强度成比例2 。 4.2 蛙神经冲动的传导速度在20时约为每秒30米 3 ，本实验所测得 的蟾蜍坐骨神经干动作电位的传导速度为 4.3 刺激蟾蜍坐骨神经干中枢端，可在其末梢端引导出动作电位，反 之也然，由此可以证明离体蟾蜍坐骨神经具有双向传导兴奋的能力。 4.5 刺激神经干中枢端在其末梢端引导所得BAP和刺激神经干末梢端在 其中枢端引导所得BAP，正相振幅均大于等于负相振幅，正相时程均 小于负相时程，由此表明在蟾蜍坐骨神经干AP引导时，两引导电极处 神经纤维的多寡不是形成BAP正相振幅大于负相振幅和正相时程小于 负相时程的主要原因。 在两引导电极间夹伤神经，神经冲动传导被阻断，双相动作电位 负相波消失，形成的单相动作电位时程显著长于双相动作电位正相时 程，单相动作电位振幅大于或等于双相动作电位正相振幅。即负相波 的存在，使双相动作电位正相波的时程和振幅减小。移动正引导电极 ，增加两电极距离，在一定范围内双相动作电位的正相波的振幅和时 程均增大。由此可以推测，正相波与负相波在时间轴上重叠，正相波 和负相波叠加。 叠加发生在正相波去极后期，正相波波峰减小，时程缩短，当神 经冲动传导被阻断使负相波消失，正相波被叠加的部分显示出来，正 相波的波幅和时程均增大。叠加发生在正相波复极期，正相波波峰不 减小，但时程缩短，当神经冲动传导被阻断使负相波消失，正相波被 叠加的复极化部分显示出来，正相波时程延长。 双相动作电位负相波的去极期完全与正相波叠加，其波幅减小 程度大于正相波。负相波的复极后期，正相波已复极完毕，没有叠 加发生，动作电位复极后期的时程较长，负相波时程缩短的程度比 正相波小。 1 Mary A.B.勃雷兹尔.神经系统的电活动.1984.第1.版.科学出版社.北京P45 2.DJAIDLEY.可兴奋细胞的生理. 1983年09月第1版.学科学出版社.北京P61 3 Mary A.B.勃雷兹尔.神经系统的电活动.1984.第1.版.科学出版社.北京P35 5. 参考文献(references) 动作