遗传病的诊断01医学医药课件

程晓丽制作 Diagnosis of genetic disease 程晓丽制作 临 症 诊诊 断断 Segment 2 Segment 2 Segment 1 症症 状状 前前 诊诊 断断 Segment 3Segment 3 出出 生生 前前 诊诊 断断 程晓丽制作 Segment 1 临症诊断临症诊断 是医务工作者根据已经出现症状的患者和各种临是医务工作者根据已经出现症状的患者和各种临 床表现进行分析，并进行疾病的诊断和遗传方式的判断。床表现进行分析，并进行疾病的诊断和遗传方式的判断。 病病 史史 采采 集集 家族史家族史：双方家族成员中有无遗传病史。双方家族成员中有无遗传病史。 婚姻史婚姻史：是否属于近亲婚配，婚龄，婚次，配偶健康状况是否属于近亲婚配，婚龄，婚次，配偶健康状况 ，生活习惯等。，生活习惯等。 生育史生育史：生育年龄，胎次，孕期病史，有无流产史、死产生育年龄，胎次，孕期病史，有无流产史、死产 、早产、难产、产程情况，有无接触过有毒物质或电力、早产、难产、产程情况，有无接触过有毒物质或电力 辐射。辐射。 1. 1. 病史、症状和体征病史、症状和体征 临临 症症 诊诊 断断 程晓丽制作 例 智力低下智力低下 黄疸黄疸 白内障白内障 肝脾肿大肝脾肿大 智力发育不全智力发育不全 毛发黄腐臭味毛发黄腐臭味 苯丙酮尿症苯丙酮尿症 ？ 半乳糖血症半乳糖血症 ？ ? ? ? ? 面似满月面似满月 生长缓慢生长缓慢 哭声象猫叫哭声象猫叫 猫叫综合症猫叫综合症 ？ ? ? 症状与体征 程晓丽制作 2. 系 谱 分 析 系谱分析系谱分析（pedigree analysis)pedigree analysis)从从先证者先证者 入手，尽可能多地调查其亲属的患病情入手，尽可能多地调查其亲属的患病情 况。这有助于遗传病与非遗传病的区别况。这有助于遗传病与非遗传病的区别 、单基因病与多基因病的区别。单基因病与多基因病的区别。 建立系谱时的注意事项：建立系谱时的注意事项：主诉的完整性；特殊情主诉的完整性；特殊情 况的存在；症状和体征检查的完整性；遗传异况的存在；症状和体征检查的完整性；遗传异 质性的存在；不完全外显与延迟外显的存在；质性的存在；不完全外显与延迟外显的存在； 遗传印记以及动态突变的存在等。遗传印记以及动态突变的存在等。 程晓丽制作 遗遗 传传 病病 诊诊 断断 中中 的的 注注 意意 事事 项项 孟德尔式遗传病孟德尔式遗传病 是指符合孟德尔式遗传特征，通常为单基因是指符合孟德尔式遗传特征，通常为单基因 病。被分为病。被分为ADAD、ARAR、XDXD、XRXR和和Y Y连锁遗传等几种类型。系谱分连锁遗传等几种类型。系谱分 析对这类疾病的分析十分有用，但要注意遗传异质性、外显不析对这类疾病的分析十分有用，但要注意遗传异质性、外显不 全以及延迟显性等造成的临床假象。全以及延迟显性等造成的临床假象。 非孟德尔式遗传病 包括线粒体病和多基因病。线粒体基因 突变所致的遗传病是母系遗传,主要表现为晚发,并进行性加 重。多基病是常见疾病，有家族聚集现象，但非孟德尔遗传 。 具有特殊遗传方式的疾病 1.遗传印记 2.动态突变 程晓丽制作 vv染色体荧光原位杂交染色体荧光原位杂交( (FISHFISH) ) vv性染色质性染色质检查检查 vv染色体检查染色体检查 核型分析核型分析 3. 细胞遗传学检查 程晓丽制作 谁 应 进 行 染 色 体 检 查 ? l l 智力发育不全生长迟缓或伴有其他先天畸形者；智力发育不全生长迟缓或伴有其他先天畸形者； l l 夫妇中有染色体异常如平衡易位，嵌合体等；夫妇中有染色体异常如平衡易位，嵌合体等； l l 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体；家族中已发现染色体异常或先天畸形个体； l l 多发性流产的妇女及其丈夫；多发性流产的妇女及其丈夫； l l 原发性闭经和男女不孕症者；原发性闭经和男女不孕症者； l l 3434岁以上的高龄孕妇；岁以上的高龄孕妇； l l 有两性内外生殖器畸形者。有两性内外生殖器畸形者。 程晓丽制作 染 色 体 检 查 程晓丽制作 性 染 色 质 检 查 X X小体小体Y Y小体小体推测核型推测核型 ？ 疾疾 病病 0 0 2 2 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 2 2 45,45,XOXO 47,47,XXYXXY 47,47,XYYXYY 性腺发育不全症性腺发育不全症 XXXXXX性腺发育不全症性腺发育不全症 先天性睾丸发育不全症先天性睾丸发育不全症 XYYXYY型综合症型综合症 1 1 2 2 48, 48,XXYYXXYY 47,47,XXXXXX XXYYXXYY型综合症型综合症 程晓丽制作 X染色体Y染色体13号染色体18号染色体21号染色体 程晓丽制作 13号染色体21号染色体 程晓丽制作 4. 生 化 检 查 疾病名称 检查的酶 材料 白化病 酪氨酸酶 毛囊 苯丙酮酮尿症 苯丙酮酮氨酸羟羟化酶 肝 半乳糖血症 半乳糖磷酸尿苷转转移酶 红细红细 胞 DMD 肌酸磷酸激酶 血清 该方法适用于分子病，先天性代谢缺陷等遗传病。 程晓丽制作 5.基因诊断 运用分子生物学方法检测患 者体内遗传物质的结构或表达水 平的变化而作出或辅助临床诊断 的技术，称为分子诊断，又叫基 因诊断。 基因诊断的材料包括：DNA，RNA 与蛋白质。 程晓丽制作 l基因诊断的基本原理 l基因诊断的基本途径 l基因诊断的常用技术 Southern 印迹杂交 聚合酶链反应 多态性连锁分析 单链构象多态性 程晓丽制作 加热加热 加碱加碱 变性变性 缓慢缓慢 降温降温 复性复性 或退火或退火 基 因 诊 断 原 理 程晓丽制作 基因诊断的基本途径基因诊断的基本途径 1.直接诊断 2. 是直接检测致病基因本身的异常，适用 于已知基因异常的疾病诊断。 3.2.间接诊断 4. 当致病基因已知而异常未知时，或致病 基因也未知，可通过对受检者及其家系进 行连锁分析，以推断前者是否获得了带致 病基因的染色体。 程晓丽制作 核苷酸探针核苷酸探针（nucleic acid probenucleic acid probe) ) 或基因探针是指一段被标记了的、特定的核苷酸序列或基因探针是指一段被标记了的、特定的核苷酸序列 (DNA/RNA)(DNA/RNA)，用于杂交筛查鉴定被测用于杂交筛查鉴定被测DNADNA或或RNARNA分子。分子。 基因探基因探 针种类针种类 1.1.基因组基因组 DNADNA探针探针 2.cDN2.cDN A A探针探针 3.3.寡核苷寡核苷 酸探针酸探针 4.RNA4.RNA 探针探针 探针的特性探针的特性 1. 1.应带有标记应带有标记2. 2.应用探针应为单链应用探针应为单链 3. 3.具有高度特异性具有高度特异性 4. 4.探针的序列应选择基因编码序列探针的序列应选择基因编码序列 一、分子杂交相关技术一、分子杂交相关技术 程晓丽制作 探针 标记物 标记探针 靶核酸 杂交体 程晓丽制作 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列 ，将双链DNA切成较小的片段。每种限制酶识别和切割的通常 为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点或切点。 限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种： 1.是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱 基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连 接，称为粘性末端； 2.为平整切割，即两条链在同一水平切开，得到平齐末端。 5GAATTC3 3CTTAAG5 EcoR 5GGCC3 3CGCG5 HaeIII 程晓丽制作 每个人的DNA是不完全相同的，一般每100500bp 就有一个是不相同的，即多态性。碱基的变异就可能 导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制 酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异 ，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差 异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变 异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹 杂交法检出。 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 程晓丽制作 等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb。 DNA片段电泳后杂交图 等位基因2 探针位置 12kb 8kb 8Kb4Kb 等位基因1 探针位置 程晓丽制作 分 子 杂 交 的 基 本 过 程 待侧核酸的制备待侧核酸的制备 待侧核酸滤膜固定待侧核酸滤膜固定 预预 杂杂 交交 制备探针制备探针 探针标记探针标记 加入标记探针加入标记探针 杂 交 去除剩余探针 检测杂交信号 程晓丽制作 1. Southern Blot 1.1.基因组基因组DNADNA2.2.用限制酶用限制酶 消化消化 3.3.凝胶电凝胶电 泳分离泳分离 变性变性5.5.探针杂交探针杂交 6.6.放射自放射自 显影显影 4.4.滤膜转滤膜转 印印DNADNA Southern Blot Southern Blot 是指将待测核酸分子结合到一定是指将待测核酸分子结合到一定 的固相支持物上的方法。的固相支持物上的方法。 程晓丽制作 例例1 1 直接分析法直接分析法 镰状细胞贫血镰状细胞贫血(HbS)(HbS)： 第第5 57 7位密码子位密码子 A A A A A A S S S S S S MstMst: : CCTNAGGCCTNAGG 1.2 Kb 1.2 Kb 0.2Kb 0.2Kb 1.40 Kb1.40 Kb 1.20 Kb1.20 Kb 0.20 Kb0.20 Kb A A : CCTG: CCTGA AGGAGGGAG S S : CCTG: CCTGT TGGAGGGAG 程晓丽制作 例2 Bgl酶对一血友病家系的RFLP分析 II 1 2 3 4 5 6 7 1 2 5/5 5/- 5/5 5/20 5/- 5/20 20/- 5/- 20/- 5kb 20kb 程晓丽制作 例例3 RFLP3 RFLP连锁分析连锁分析 Neurofibroma, NFNeurofibroma, NF 1 1 RFLPRFLP 1 21 2 1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 4.7 kb 3.0 kb 程晓丽制作 5.6 Kb 5.2 Kb 4.2 Kb 4.0 Kb Hind PKU，AR 1 2 1 2 3 Sph 11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 Kb 例例4 4 单体型分析单体型分析 程晓丽制作 当基因的突变部位和性质已完全明了时， 可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（ASO） 用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的 探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之 稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另 一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列 稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交， 这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基 因区别开来。 2. ASO（allele-specific oligonucleotide） 程晓丽制作 ASOASO斑点杂交斑点杂交 19861986年，胡流清等基于点突变原理，用年，胡流清等基于点突变原理，用 寡核苷酸探针进行基因诊断。寡核苷酸探针进行基因诊断。 正常探针正常探针 突变探针突变探针 PKUPKU，ARAR 程晓丽制作 PCRPCR是一项在模板、引物、耐热是一项在模板、引物、耐热DNADNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTP、 适宜的温度变化等条件下，按照变性、复性、引物延适宜的温度变化等条件下，按照变性、复性、引物延 伸，循环往复伸，循环往复20 4020 40个周期，体外快速合成扩增个周期，体外快速合成扩增 DNADNA的技术。的技术。 高高 温温 低温低温 退火退火 中中 温温 模板模板 DNADNA 引物与引物与 模板结合模板结合 引物延伸引物延伸 周期周期1 1 周期周期2 2 变性变性 二、聚合酶链反应（二、聚合酶链反应（PCRPCR）相关技术）相关技术 程晓丽制作 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction,PCR） PCR原理 程晓丽制作 PCR原理 变性 程晓丽制作 PCR原理 复性 程晓丽制作 PCR原理 延伸 程晓丽制作 PCR原理 变性 程晓丽制作 PCR原理 复性 程晓丽制作 PCR原理 延伸 程晓丽制作 PCR原理 变性 程晓丽制作 PCR原理 复性 程晓丽制作 PCR原理 延伸 程晓丽制作 DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线 性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两 个引物之间。 长片段（单链） 240 16 256 11452228200短片段（单链） 1412108642 128643216总片段（单链） 循环数 程晓丽制作 预变性(92-95C,2-5m) 变性(92-95C,30s) 复性 (40-60C,30s) 延伸 (72C,30-60s) 总延伸 (72C,7m) (25-35) PCR的一般过程： 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 程晓丽制作 1.2 kb 0.2 kb1.2 kb 0.2 kb 镰状细胞贫血镰状细胞贫血( (HbSHbS) )： 第第5 57 7位密码子位密码子 MstMst: : CCTNCCTNA AGGGG A A : CCTG: CCTGA AGGAGGGAG S S : CCTG: CCTGT TGGAGGGAG PCR-RFLPPCR-RFLP 程晓丽制作 PCR-RFLPPCR-RFLP 程晓丽制作 SSCP技术 对照DNA被检DNA 单链DNA片段呈复杂的空间 折叠构象，这种立体结构主要 是由其内部碱基配对等分子内 相互作用力来维持的，当有一 个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象 发生改变。 程晓丽制作 PCR-SSCPPCR-SSCP 19891989年，年，OritaOrita等等建立的建立的PCRPCR产物单链产物单链 DNADNA凝胶电泳技术。凝胶电泳技术。 1 2 3 4 5 a b 1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者 程晓丽制作 GAAGAGTGTTATCTCCAC PCR-SSCPPCR-SSCP 程晓丽制作 在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称 为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每个重复单位通 常只有几几十个碱基对，但其重复次数在人群中 是高度变异的，又叫数目变异的串联重复（variable number tandem repeats,VNTR）。当用限制酶切割 VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各 种长度不同的片段，可用于致病基因的连锁分析。 探针 酶切后电泳VNTR 程晓丽制作 IV 1 2 I 1 2 III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 II 1 2 3 4 5 6 45 41 44 424630 例如：延迟显性遗传病的诊断 正常人IT15基因 (CAG)n 26 表型正常前突变个体 27(CAG)n 35 不完全外显个体 26(CAG)n 39 完全外显患者 (CAG)n 40 Segment 2Segment 2 症状前诊断 程晓丽制作 出生前诊断 Segment 3 对胚胎或胎儿 在出生前是否患有 某种遗传病或先天 畸形做出的诊断称 为产前诊断，又叫 宫内诊断。 程晓丽制作 产前诊断的对象 l年龄在三十五岁以上的高龄孕妇； l曾生育过染色体异常的患儿的夫妇； l夫妇一方有染色体数目或结构异常者； l有先天性代谢缺陷或生育过此类患儿的夫妇； l夫妇一方为严重性连锁隐性遗传病携带者； l生育过多发畸形患儿的夫妇； l有原因不明的多发流产、死产或死胎的夫妇； l有明显致畸因素接触史的夫妇； ？ 程晓丽制作 l一、创伤性方法：包括羊膜穿刺、绒毛 取样、脐周血取样、胎儿镜和胚胎火检 等； l二、