土霉素（terramycin）四环素课件

第九章 其他抗生素 第一节 四环类 有金霉素 (aureomycin)、土霉素(terramycin)、四环素 (tetracycllne)、地美环素(去甲金霉素)及其半合成衍生物 如多西环素(强力霉素)、美他环素(甲烯土霉素)、米诺环素( 二甲胺四环素)等。 四环素：C22H24N2O8， R=R“=H，R=CH3 土霉素：C22H24N3O9，R=H ，R“=OH，R=CH3 金霉素：C22H22ClN2O8， R=Cl，R“=H，R=CH3 地美环素：C21H21ClN2O8， R= Cl，R“= R=H HH H H “ A BC D 四环素类抗生素的疗效 四环素：血液中能维持一定浓度，毒性低，疗效好，医疗上 应用较广。 金霉素：副作用较大，可以引起严重肠胃道反应和呕吐等。 但金霉素对一些耐青霉素的金葡菌所引起的各种严重感染有 相当疗效，而这些感染却不能为四环素或土霉素所控制。 土霉素：对呼吸道感染及肠道感染均有相当疗效。土霉素控 制阿米巴肠炎及肠道感染的效果胜过四环素、多西环素、美 他环素、米诺环素等。 畜用土霉素：需量很大，治“猪瘟”及“猪喘气症”的疗效 比四环素为好。防止某些畜禽疾病，促进动物生长 效果好。 一、四环类抗生素的性质及合成机理 (一)、理化性质 溶解性：四环类抗生素在pH4.5-7.2间难溶于水，且此间溶解 度几乎一定，较酸较碱液中，溶解度大些，盐类易溶，过剩的 酸可防水解及析出碱。在极性弱的溶剂中，如酯、醚、芳烃或 脂肪烃等，溶解度较小或不溶解。在有机溶剂中，其盐酸盐和 游离碱的溶解度是相近的。无水土霉素和四环素在四氢呋喃和 1，2二甲基乙烷中的溶解度能达到10左右。土霉素碱在含 水溶剂中的溶解度低于纯溶剂，而其盐酸盐则相反。土霉素盐 酸盐最好的溶剂是醋酸和90丙酮。 晶体性质：黄色结晶物。从水中结晶得到的四环素含6分子结晶 水，水的含量达到19.6。含水有机溶剂中得到的四环素含3分 子结晶水。从水中结晶得到的土霉素则含2分子结晶水，水的含 量达到7.5。加热失去结晶水。他们都有吸湿性，含水量分别 低于19.6和7.5的四环素和土霉素放在空气中吸收水分。固 体四环类抗生素较稳定。 pH稳定性：四环类抗生素的水溶液在不同pH值下的稳定性差别 很大。例如，金霉素在碱性条件下很不稳定，在pH值为14.0、 9.8、7.6时的半衰期分别为40s、3.5h和12h。在酸性条件下四 环素较稳定。四环类抗生素对各种氧化剂，包括空气中的氧气 在内，都是不稳定的。其碱性水溶液特别容易氧化，颜色很快 变深形成黑色。成品在贮存中颜色变深也和空气中氧的作用有 关。 (二)、化学性质和降解反应 1脱水化合物 在弱酸性溶液中稳定,较酸的溶液中(pH2)，四环素因6位上的 叔羟基易脱落，在5a6位上形成双键破坏,由于新双键的影响 ，C-11、C11a、C-12上双键发生转移，而使环C芳构化。 脱水四环素和金霉素中，因双键数增多，色泽加深呈稳定黄色 。此反应可用于四环素和金霉素的化学鉴定。 2差向化合物 3. 降解反应 弱碱性中,C环打开,进一步水解为酸 4. 螯合物与复合物 与金属离子如:铁、铝、铜、钴等形成螯合物 与硼酸、磷酸、六聚偏磷酸盐形成复合物使 带杂质 与尿素形成沉淀用于精制 紫外光下能产生荧光，该性质 用于纸上层析和薄板层析中。 层析谱用氨气熏，几秒后，四 环类抗生素和其差向物以及乙 醚去酰氨衍生物呈黄绿色荧光 ，而脱水物呈橙色，异四环类 抗生素呈紫色荧光。 (三)、四环素的合成机理 二、四环素的发酵工艺 (一)、生产菌种 菌种：金色链霉菌 (Saureo fa-ciens)、诺卡菌属 、马杜拉放线菌属。 菌落特征：金霉菌在马铃薯、葡萄糖等固体培养基中 生长，营养菌丝分泌金黄色色素，但气生菌丝没有颜 色。孢子初形成是白色，28培养57d，孢子从棕 灰色变为灰黑色。孢子形状呈圆形或椭圆形，也有方 形或长方形，孢子在气生菌丝上排列成链状。 (二)、种子制备及控制要点 1孢子制备 砂土孢子接种斜面时进行一次自然分离，挑选菌落形态正常者 接种在第二代斜面上。 流程为：砂土管母斜面子斜面种子罐发酵罐 2种子培养 种子培养基：蛋白胨、花生饼粉、淀粉等 培养条件：3032，经2427h培养即可成熟 成熟标志：菌丝形态处在第期末或第期初；菌体处于代谢 旺盛阶段，碳、氮源明显被利用；pH值下降后又上升，达到 6.0左右；培养液因菌丝增加而黏稠，色泽逐渐带黄色，并出 现少量四环素。 种子培养时通气、搅拌对种子的生长有很大的影响。 (三)、影响发酵的因素及工艺控制要点 四环素生产一般采用二级或三级发酵方式。 1培养基 氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、(NH4)2S04、NH4Cl、 NH4N03、尿素等，脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨 酸、组氨酸、苏氨酸及胱氨酸均能刺激金色链霉菌产四环素或 金霉素。过量的氮源，抑制四环素的合成。含100200mg/L氨 基氮的氨基酸较适宜。 碳源：淀粉(也可用玉米淀粉、燕麦粉、土豆粉等代替一部分) 、可溶性淀粉、葡萄糖、糖蜜及油脂等。采用玉米淀粉作为培 养基时，可在灭菌前预先用酶进行水解，对提高发酵单位有利 。 抑氯剂：用金霉菌生产四环素，加入竞争性的抑氯剂-溴化钠 和抑氯剂促进剂M(2巯基苯并噻唑)，阻止金霉素，促进四 环素合成，使金霉素在总产量中低于5。浓度较大对菌有毒 。 P：从10gmL增至45gmL，菌体的比生长速率快速增加 ，但增至270gmL时，不再变化。 铁离子及其他无机离子：含铁达70gmL，发酵单位只有对 照的40。 抑制离子：硼、钴、锂、锌、钼、钨、铝 促进离子：镁盐、钙盐。碳酸钙能与菌体合成的四环素结合成 水中溶解度很低的四环素钙盐，降低水中可溶性四环素的浓度 ，菌丝体进一步分泌四环素。 2培养温度 培养温度不仅影响四环素的产量，且改变金色链霉菌生物合成 的方向。 3pH值的影响 金色链霉菌生长的最适pH值为6.06.8，而生物合成四环素的 最适pH值为5.86.0 。 4.溶氧的影响 溶氧在1260h的阶段内敏感。此阶段中菌丝量显著增加。此 阶段现导致溶解氧降低的因素，如停止通气或搅拌、闷罐等， 或一次大量加消沫油、提高罐温及补料等，都能明显改变菌体 的正常代谢，影响四环素生物合成。 5.二氧化碳：28mL100mL范围内四环素产量较高，如二氧 化碳浓度超过15，则将使菌体的呼吸率降低4550。 三、四环素的提取和精制 1、多用沉淀法 (一)、发酵液的预处理 因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中四环素浓度不 高，仅有100300U/mL的浓度。用草酸或草酸和无机酸的混合物 酸化到pH 1.52.0 (二)、四环素提取 1沉淀法 提取：调pH 9.0左右，加一定量氯化钙，形成钙盐沉淀,以草酸 溶液溶解，草酸钙析出，过滤得滤液。滤液调pH4.64.8，析出 四环素粗碱。粗碱再溶于草酸溶液中，经活性炭脱色，然后调 pH4.0，得四环素碱成品。也可用碳链为C10C30的季铵碱来沉淀 四环类抗生素。 结晶：联罐结晶，操作可连续，提高设备利用率。结 晶温度10左右，温高，母液单位增大。搅拌转速90 120rmin为宜，太高粒子过细，分离难。结晶时加 些尿素晶体比较紧密，含水量较低，晶体易过滤。析 出的结晶碱可用4045热水洗涤，如不易结晶时， 也可加些晶种。 四环素精碱制造盐酸盐：利用其盐酸盐在有机溶剂中 、在不同温度下有不同的结晶速度的性质。温度升高 ，结晶速度增大。为此将四环素精碱悬浮在丁醇中， 加入化学纯浓盐酸，温度18，迅速滤掉不溶解杂 质，加热，即有盐酸盐析出，用无水丙酮洗涤，干燥 ，得盐酸盐成品。 2离子交换法 四环类抗生素在酸性下(当pHpKa3.3)，成一价阳离子 ;在等电点附近(pH5.4),成偶极离子；碱性成一价阴离子 ,碱性增加形成二价阴离子：因此磺酸型树脂在酸性条件 下能吸附四环素。 通常用强酸13树脂(含3二乙烯苯)。 缺点：生产周期较长；由于树脂本身的酸性很强，而形 成脱水四环素。因此质量、收率都较低。另外，强酸 13树脂的机械强度较差，易破损。 3四环素纯化方法 为减少成品中差向四环素的含量，可通过四环素与尿素生成复 合物而纯化。如四环素粗品溶液加入12倍量尿素，调至 pH.3.5-3.8，就沉淀出四环素-尿素复合物。此复合物可转变 为四环素盐酸盐，与从碱转变为盐酸盐的方法相同。 制备盐酸盐时用丁醇作为溶剂。但也可用丁醇：乙醇(3:1)混 合溶剂，加入乙醇可使浓度提高到20104 UmL，降低母液中 四环素损失，提高设备生产能力和能更有效地去除差向四环素 和ADT等杂质。ADT(2-乙酰-2-去酰胺衍生物)是四环素生物合 成中的副产物，在提炼中很难除去。只有在制备四环素盐酸盐 时能去除相当数量(不超过50)的ADT。降低成品中ADT含量的 最有效方法是筛选不产生ADT的菌株。 第二节 氨基糖 苷类抗生素 一、概述 (一)、氨基糖苷类抗生素的应用 (1)抗结核杆菌作用氨基糖苷 天然产物：链霉素、卡那霉素 (2)具有抗脓绿杆菌活性的氨基糖苷 天然产物：庆大霉素、妥 布霉素、小诺米星、西索米星。半合成品：阿米卡星 、地贝卡 星、异帕米星、依替米星、奈替米星。 (3)抗革兰阳性菌与阴性菌，不抗结核杆菌与绿脓杆菌的氨基糖 苷 天然产物：核糖霉素、卡那霉素B、阿司米星。 (4)具有特定用途的氨基糖苷 天然产物：大观霉素（淋病用) 、新霉素(局部用)、巴龙霉素(肠道用)、阿贝卡星(抗MRSA用) 。 (二)、氨基糖苷类抗生素的分类 二、链霉素的结构、性质及合成机理 (一)、链霉素的结构 链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，是 由链霉胍、链霉糖、N-甲基L葡萄糖胺构成的糖苷。 链霉素又称链霉素A，其化学名为N甲基-L-葡萄糖胺 (12) -L-链霉糖(14)链霉胍。链霉素中链霉糖部分 的醛基被还原成伯醇后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和 链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素的 硫酸盐。甘露糖链霉素又叫链霉素B，它可能是链霉素生物合 成中的支路产物，其生物活性比链霉素低得多，只有链霉素的 2025。链霉素或双氢链霉素的效价标准，系以1g链霉 素碱为1个单位。由此可算链霉素各种盐的效价。 (二)、链霉素主要理化性质 1物理性质 2稳定性 3. 溶解度：易溶于水，难溶有机溶剂，但盐酸盐易溶甲 醇、难溶乙醇，硫酸盐难溶甲醇。 4. 光学性质 5链霉素盐类的性质 6. 链霉素的降解反应 7. 氧化还原反应 8醛基反应 (三)、链霉素的 合成机理 链霉素的合成机理 图 1 链霉素的合成机理 图2 链霉素的合成机理 图3 链霉素的合成机理 图4 三、链霉素发酵生产艺 (一)、生产菌种 早期菌种是灰色链霉菌，后来又找到产链霉素或其 他类型链霉素族抗生素(如羟基链霉素或双氢链霉 素)的菌种。如比基尼链霉菌(Sbikinien-sis)、 灰肉链霉菌(Sgriseocarneus)等。 灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量 很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单 菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为3 4mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素 。 (二)、发酵工艺及控制要点 生产采用三级或四级发酵培养，其过程一般包括斜面 孢子培养、摇瓶种子培养、二级或三级种子罐扩大培 养、发酵培养及提取精制等。 1、斜面孢子培养 斜面培养基主要有葡萄糖、蛋白胨和豌豆浸汁等，其 中蛋白胨和豌豆浸汁的质量对斜面孢子质量影响很大 ，需特别注意。原始斜面的质量要求：菌落分布均匀 ，密度适中，颜色洁白，单菌落丰满。生产斜面上的 菌落应为白色丰满的梅花型或馒头型，背面为淡棕色 色素。 2、摇瓶种子培养 链霉素发酵经常使用摇瓶种子来接种种子罐。种子质 量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝黏度或浓度、糖氮代 谢、种子液色泽和无杂菌检查为指标。摇瓶种子(母 瓶)可以直接接种子罐，也可以用培养所得的子瓶接 种。摇瓶种子合格后冷藏时间7天。摇瓶培养基为 黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙等，其中黄豆饼 粉的质量和葡萄糖的用量对种子质量都有影响。 3、种子罐扩大培养 种子罐培养为23级，可根据发酵罐的体积大小和接 种量来确定。第一级种子罐一般采用摇瓶种子接种， 23级种子罐则是逐级转移，接种量一般为10左右 。 4、发酵罐培养及控制要点 (1) 链霉素的发酵培养基 培养基：葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐 和碳酸钙等 。 碳源：葡萄糖是链霉素发酵的最适碳源，葡萄糖的用量 ，视补料量的多少而定，总量一般在10以上 。 氮源：为有机氮源和无机氮源。有机氮源包括黄豆饼粉 、玉米浆、蚕蛹粉、酵母粉和麸质水，其中以黄豆饼粉 为最佳，其他可作为辅助氮源。无机氮源以硫酸铵和尿 素为最常用，氨水可作无机氮源使用，可又调节发酵pH 值。 游离的氨基酸对链霉菌的生长和生物合成有促进作用。 谷氨酸和天冬氨酸主要是促进菌丝生长的；脯氨酸，组 氨酸、精氨酸等主要是促进链霉素生物合成；甘氨酸、 丙氨酸等对链霉菌的生长和生物合成都有促进作用。 无机元素：磷颇为重要，灰色链霉菌的无机磷浓度一 般为46.5465mgL，具体用量据菌种和培养基成分 确定。磷酸盐抑制链霉素合成的实际浓度与糖的种类 有关 。 其他无机离子，一般不需再添加。需注意的是Fe2+浓 度起过60gmL以上，就产生毒性。 (2) 链霉素发酵条件及中间控制要点 a 溶氧的影响及控制 b 温度的影响及控制 c pH值的影响及控制 . d 中间补料控制 四、链霉素的提取和精制 以硫酸链霉素的一种提炼工艺流程，说明离子交换 法提炼链霉素的生产过程及控制要点。 发酵液 过滤 吸附 洗脱 脱色、中和、精 制 精制液脱色、浓缩 成品浓缩液 无菌过滤得水针剂 无菌过滤+干燥得粉针剂 1发酵液的过滤及预处理 原滤液的质量标准是：外观澄明；pH6.77.2； 温度10以下；高价离子含量很少；链霉素浓 度为5000UmL。 2吸附和解吸 用羧酸树脂的钠型阳离子交换树来提取链霉素。对大 分子，要注意树脂的膨胀度，它对链霉素的交换容量 和树脂本身均有影响。膨胀度小，机械强度虽大，但 链霉素大分子不能进入树脂内部，影响交换容量； 常用两种树脂：弱酸1014(724号)；弱酸1103 。后者对链霉素交换容量较大，但机械强度较差。 为防链霉素损失：采用三罐或四罐串联吸附，依原滤 液流向分别称为主、副、次等交换罐。 最后一罐流出液单位在100UmL以下。当主 罐流出液中的浓度达进口浓度的95左右时， 认为已达饱和，可以解吸。将副罐升为主罐， 次罐升