抗体检测技术ppt课件

HIV抗体检测技术 l艾滋病病毒的形态 v HIV的逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性 ， v 无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。 HIVHIV颗粒颗粒 HIV生活周期 吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放 HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合 HIV感染后的血清学改变 艾滋病诊断的特殊性 l高度依赖实验室诊断 lHIV检测的严肃性： 保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题 l结果严格保密 l筛查试验 初筛 复检 l确证试验 HIV抗体检测程序 筛查试验 筛查试剂 l必须是经国家食品药品监督管理局 l注册批准、在有效期内的试剂，其中 l酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用 l临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 HIV抗体筛查样品 l血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。 初筛试验 l对呈阴性反应的样品，可出具 lHIV抗体阴性（-）报告； l对呈阳性反应的样品，需要进一步 l做复检试验和确证试验。 复检试验 l对初筛呈阳性反应的样品，应使用 l原有试剂和另外一种不同原理（或厂家） l的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家 l的试剂进行复检试验。 l如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必 须包括一种抗原抗体联合试剂。 l艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样 品，确证实验室可以直接进行确证试验。 筛查方法 l酶联免疫吸附试验（ELISA） l化学发光或免疫荧光试验（CLIA）： l采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪 l测定结果。 l快速检测（RT）及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (3)免疫层析试验 HIV抗体筛查试验 (1)酶联免疫吸附试验（ELISA） l可使用血液、唾液、尿液样品 l单纯HIV抗体检测试剂 lHIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中 l HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。 lHIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品 l和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪 l测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。 固相抗原 标本（含抗体） 酶标二抗 底物 E EE 间接法检测抗体 E 固相抗原 标本（含抗体 ） 酶标抗原 底物 E E 双抗原夹心法检测抗体 ELISA法结果判断 临界值概念: 将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值 代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值 判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于 1(S/CO1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法） 注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同 cutoff=NC+0.1 cutoff=NC*2.1 四代艾滋病酶联免疫试剂比较 solid phase specific detection of conjugate 第一代 病毒裂解液 HIV-1 IgG 抗体 HIV-1 -IgG抗体 第二代 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 IgG 抗体 HIV-1 / -2 IgG抗体 第三代 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O 第四代 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原 病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体 method 间接 间接 夹心 夹心 酶联免疫吸附试验（ELISA） 优点：准确性高、价格低廉、 判断结果标准客观、 结果便于记录和保存 用途：流行病学监测及临床大量标本的检测 (2)化学发光或免疫荧光试验 采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也 可联合检测抗原抗体。 HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检 样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加 发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结 果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合 试剂盒规定。 （3）快速检测（RT）及其它检测试验 优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急 诊检测。不需专门设备,人员培训简单,一般 可在1030分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保 存。 HIV快速检测试剂按原理不同，分为以下三类： 1 免疫渗滤试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点 状 固定在膜上。加待检样品后，阳性结果在膜上抗 原部位显示出 有色斑点。有效试验质控点必须显色 。 2 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线 状 固定在膜上，加待检样品后，阳性结果在膜上抗 原部位显示出 有色条带。有效试验的质控带必须显 色。 3 明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶 颗粒 作为载体，加待检样品后。当待检样品含有 HIV抗体时，明胶颗 粒与抗体发生凝集反应，根据 凝集情况判读结果。 （1）明胶颗粒凝集试验（PA） 将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与 待检样品作用，混匀后保温（一般为 室温）。当待检样品含有HIV抗体时， 经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗 原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的 凝集情况判读结果。 快速诊断试剂 PA法原理 PA法操作步骤 PA法 （2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒 ） 以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在 膜上,加血清样品。 斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同 ELISA。 斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶 体金（或胶体硒）A蛋白标记，用渗滤法作 为洗涤方法。 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点 。反应时间在10 min以内，使用抗原量少 。 快速诊断试剂 金标诊断试验原理 快速诊断试验 （3）免疫层析试验(金标法、硒标法) 以硝酸纤维膜为载体。 加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金- protein A结合物 测试区（T）：固定有重组HIV抗原， 质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A 抗体 快速诊断试剂 全血样品 加50ul样品于样品垫中 手指血方法 静脉血方法 加一滴缓冲液 15分钟内读取结果 硒标法操作步骤 病人条 质控条 快速诊断试验 优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急 诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在10 30分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保 存。 注意：一定要将试剂平衡至室温 快速诊断试剂 HIV抗体确认试验 确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理 局注册批准、在有效期内的试剂。 确认试验方法： 免疫印迹试验(WB) 条带免疫试验(LIATEK HIV) 放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光 试验(IFA) 国内常用的确认试验方 法是WB。 HIVHIV抗体确认实验结果抗体确认实验结果 a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2） b弱阳性对照（HIV-1） c阴性对照 d典型的HIV-2血清阳性反应 a b c d a b c d gp160gp160 gp120gp120 p66 p66 p55p55 p51 p51 gp41gp41 p39p39 p31 p31 P24P24 p17p17 血清对照血清对照 HIV-2HIV-2特异带特异带 HIV核酸定性检测 规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、 检测方法及结果判定标准 结果报告 ： HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。 HIV核酸检测阳性:可作为诊断HIV感染的辅助指 标，不单独用于HIV感染的诊断。 严格的实验室管理制度（分区、仪器和材料的专 用、单向流向、废弃物处理） HIV RNA定量测定（病毒载量测定） 方法 常用的HIV RNA定量测定方法有逆转录PCR试验（RT-PCR ）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试验（ bDNA）。 HIV核酸定量检测的意义 辅助诊断：当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果 时（3，000c/ml），感染发生的可能性非常大。 应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断 。 早期诊断 ：HIV感染孕妇所生婴儿 、残余危险度 病程监控 ：确定疾病发展的阶段，以确定相应的治 疗方案。 指导治疗方案及疗效判定 ：通常在治疗前后病毒水 平降低0.5 log以上才被认为临床有效。 预测疾病进程 适用范围： HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断； HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助 鉴别诊断； 第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳 性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断 ； 监测病程进展和抗病毒治疗效果。 检测方法：通常是采用ELISA双抗体夹心法 。 HIV P24抗原的检测 结果报告和解释 HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试 验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减 少50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳 性。 HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的 辅助诊断依据，不能据此确诊。 HIV-1P24抗原检测的敏感性为3090，低 于病毒载量测定。HIV-1P24抗原阴性结果只 表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。 样 本样 本 初筛检测初筛检测 一阴一阳一阴一阳均阳性反应均阳性反应 阴性报告阴性报告送确认送确认 重复检测重复检测阴性报告阴性报告 均阴性反应均阴性反应 阳性反应阳性反应 原有试剂另一原有试剂另一 种原理初筛试剂种原理初筛试剂 选用初筛试剂选用初筛试剂 阴性反应阴性反应 HIVHIV抗体筛查检测流程图抗体筛查检测流程图 筛查试验阳性反应样品 HIV抗体确证检测流程图 结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应， 则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进 展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应 则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准 可视情况决定是否继续随访。 确证试剂 根据具体情况进一步 检测HIV-2 报告阴性 出现HIV-2指示条带阴性反应不确定反应 报告HIV-1 阳性 HIV-1 阳性反应 HIV抗体检测的要点 1、根据目的选择检测方法及检测策略。 2、严格遵守实验室SOP。 3、筛查试验阳性，须作确证实验。 4、筛查试验阴性，不应做确证实验。 5、筛查及确证试验阳