核酸荧光染色技术在血液分析仪课件

核酸荧光染色技术在血液 分析仪的最新应用 希森美康医用电子（上海）有限公司 一.概 述 n技术： 电阻抗、光散射、高频波、化学染 色、及流式细胞术。 n目的： 精确定量检测白细胞的五种亚型。 1.五分类与三分类的主要区别： 鞘流 CELLPACK CELLPACK 样本 半导体激光 激光波长: 633nm 2.半导体激光流式细胞 半导体激光流式细胞 半导体激光+流式细胞 半导体激光提供的细胞信息 n前向散射光(FSC)：反映细胞大小。 n侧向散射光(SSC)：反映细胞的内容物 如核和颗粒。 n侧向荧光(SFL)：反映细胞内DNA、 RNA的含量。 3.高端机的作用 n普通机对异常标本报警的灵敏度有限，常 漏报。 n为了提高灵敏度，降低报警阈值，导致假 阳性率升高。 n致力于高灵敏度地检测粒细胞的幼稚、异 常成分。 1.白细胞系统 2.红细胞、血小板系统 n检测网织红细胞和有核红细胞，并能对网织 红细胞的成熟度进一步分类。 n对于存在巨大血小板、血小板聚集、小红细 胞或细胞碎片的样本，采用核酸染色加光学 流式原理能准确检测血小板。 二.核酸荧光染色加流式 白细胞分类原理及临床应用 细胞浆的组成 n核糖体：RNA占60%，PRO占40% n线粒体 n内质网 n高尔基体与中心粒 n微管 n微丝 n溶酶体 细胞核的组成 n核膜：胞浆中内质网的延伸。核孔是核浆与胞 浆交流及RNA进入胞浆的通道。 n核染色质：由DNA、组蛋白、非组蛋白组成。 n核仁：核仁丝与颗粒成分含RNA,核仁染色质含 DNA。 n核浆：是细胞核体积随细胞成熟而变小的原因 。 细胞发育成熟的变化 n细胞越幼稚，细胞核越大。 n细胞越幼稚，核染色质越疏松细致，核 仁越明显。 n越幼稚细胞浆越少，瑞氏染色着色越深 ，表明浆内RNA含量越高。 1.DIFF 检测通道 检测参数 nLymphocytes nMonocytes nEosinophils nNeutrophils,+ Basophils nother 溶解 (WBC membrane is weakly damaged) 染色 RNA DNA DIFF 试剂作用示意图 Blast, IG. Abnormal Lymph , etc. 高荧光信号 低荧光信号 高荧光信号 Normal Cell 正常DIFF与BASO散点图 4 DIFF 通道 侧向散射光 (内部结构) 荧光(RNA, DNA) 有核细胞在4DIFF散点图上的分布 4DIFF散点 图 2. WBC/Baso 检测通道 检测参数 qWBC qBasophil BASO 试剂作用示意图 BASO other WBC RBC Hemolysed (Acid, hypotonic solution) WBC/BASO-散点图 Side Scatter (Internal structure) Forward Scatter(Volume) BASO WBC 成人T细胞白血病（ATL）： n与人类T淋巴细胞病毒型(HTLV- )相关 的疾病。 nCD4+的细胞是HTLV- 和HTLV- 主要 侵袭的细胞，是此类病毒的受体。 n其免疫表型： T细胞成熟标志： CD4+ CD3+ CD2+ CD6+ T细胞活化标志： CD25(IL2受体链)+ 实例分析 n外周血中可出现多形淋巴细胞:淋巴细胞 大小不等，核染色质中等致密，核仁模 糊不清，核明显不规则，呈多形性改变 ，扭曲、畸形或呈分叶状，核凹陷很深 ，呈二叶或多叶，或呈棒球状、手套状 或折叠为花瓣状，故也称花细胞。 n形成原因：机体在某些因素的作用下， 细胞的增殖紊乱，失去控制，由二极有 丝分裂转变为三极或多极分裂；可有不 对称的核分裂，分裂后形态奇异。 ATL 大颗粒型淋巴细胞白血病(LGLL) n正常人血象中的颗粒型淋巴细胞属大淋巴细 胞，大部分为NK细胞，部分为T细胞。 nLGLL：T-LGLL与NK-LGLL n颗粒性原幼淋巴细胞胞浆在瑞氏染色中常染 成蓝色，胞浆中出现515粒清晰的粗大的 颗粒。 n诊断标准：骨髓中颗粒性原幼淋巴细胞应: 5% ，一般10% 。 LGLL N-T-ALL nN-T-ALL通常为B淋巴细胞系统白血病 ，极少为起源于淋巴干细胞或性质不明 。 n分型： 型：无标志型 型：普通型 型：前B细胞型 型：B细胞型 n主要表型标志：HLA-DR、CD19、 CD20、CD10的表达不同。 B-ALL CML急变 AML-M2 AML-M3 AML-M4 M5b 三.核酸荧光染色检测网织红细 胞参数原理及临床应用 RET 检测通道检测参数 nRET nIRF nLFR nMFR nHFR nPLT-O RET 试剂作用示意图 染色: Ploymethine: RNA Oxazine: DNA RET WBC RBC 高荧光信号 很低荧光信号 非常强的荧光信号 Fluorescence(RNA) RET散点图 Forward Scatter(Volume) MFRHFRLFR PLT RBC-O RET WBC IRF IRF MFRHFRLFR PLT RBC-O RET WBC IRF IRF 网织红细胞散点图 nIRF是评价肿瘤化疗后骨髓造血功能受抑 和开始恢复的较敏感的指标。 n较RET#达到正常参考范围低限要早14 天。 网织红细胞参数检测的临床意义 nMugurama应用R-1000对27例白血病和淋 巴瘤病人，在化疗期间作了网红各参数的系统 观察。 n发现有14例在化疗开始时，HFR+MFR的降 低早于中性粒细胞和血小板。 n有37.2%的病例HFR+MFR与其它参数同时 降低。 n在骨髓恢复时，52.8%的病例HFR或MFR迅 速升高，HFR+MFR与WBC、PLT同时升高 的仅占25%。 n Kageoka等利用Sysmes R-1000分 析了骨髓和外周血中网红与造血状态 的关系，发现外周血网红计数用于分 析骨髓造血状态优于白细胞计数和血 小板计数，化疗后骨髓造血功能从抑 制到恢复时，末梢血中HFR的增高较 WBC的增加早数天。 n外周血造血干细胞移植后病人的IRF%升高提 示有较多未成熟细胞从骨髓进入外周血，表明 该病人骨髓的造血功能已开始恢复。 n从我们观察的病例可以看出，移植后IRF在一 定时间内可以出现并升高，则病人死亡率为零 。 n因此我们认为IRF的变化较网织红细胞总数变 化具有更重要意义，IRF%的变化可作为评价 肿瘤病人化疗或外周血干细胞移植过程中骨髓 造血功能受抑和开始恢复的较敏感指标。 四.核酸荧光染色加流式检测有 核红细胞原理及临床应用 NRBC 试剂作用示意图 WBC NRBC RBC 高荧光信号 体积：大 低荧光信号 体积: 小 弱荧光信号 体积: 很小 溶血 (WBC membrane is weakly damaged) 染色 RNA DNA NRBC散点图 Forward Scatter(Volume) RBC Ghost NRBC WBC Fluorescence NRBC 散点图 NRBC散点图 WBC区域 NRBC区域 红细胞碎片 n低值CV为3.42 n中值CV为1.64% n高值CV为1.39% n该精密度水平超过了NCCL对血液分 析仪进行细胞计数的精密度要求3 。 检测NRBC的高精密度 2.NRBC? 原理 2.有核红警号（NRBC?）性能评价 n检测灵敏度为94.3% n检测特异性为97.8% n阳性预期值为76.7% n阴性预期值为99.6% n检测总有效率为97.6% n警号“NRBC?”假阳性率为23.3，其可 能的原因有： XE-2100每个NRBC测试需分析 10,000个以上的有核细胞，而血涂片法 仅检测200个有核细胞。 血液标本中可能存在死亡的小淋巴细胞 ，其体积及荧光强度与NRBC的裸核相 近。 n警号“NRBC?”假阴性率为0.44%。 n其可能原因为：漏检测的NRBC均为 嗜碱性NRBC，其胞浆着色偏蓝，表 明该细胞浆内核酸含量较高，因此在 白细胞分类散点图上可能出现在淋巴 细胞区域。 有核红细胞检测的临床意义 nNRBC只有在异常情况下才会出现在外周血 循环中 n非正常生理情况（早产儿） n强烈促红细胞生成素刺激 n造血功能严重不全 n以及组织缺氧状态 n确保白细胞计数的准确 五.核酸荧光染色加流式检测血 小板的原理及临床应用 光学法血小板检测原理 在激光流式通道内，663nm 波长的激光照射细胞，用流式 细胞方法绘出前向散射光（ FSC）和侧向荧光（SFL）。 在血小板散点图，血小板体积 较红细胞小，分布在红细胞下 方，血小板内含极少量的核酸 ，侧向荧光的强度较成熟红细 胞稍大。 PLT-O 散点图 PLT -O PLT -O Sysmex XE-2100阻抗法、光学法计数 血小板与红细胞/血小板比率法的比较 研究 引言 n准确计数血小板在血小板减少性疾病的诊断 和治疗过程中非常重要。 nSysmex XE-2100血液分析仪： 阻抗法 血小板(PLT-I) 光学法 血小板(PLT-O) n国际血液学标准化委员会(ICSH)和国际实验 血液学委员会(ISLH)推荐方法： 红细胞/血小板比率法血小板(PLT-R) 实验仪器与原理 一.血液分析仪 Sysmex XE-2100全自动血液分析仪 1234567891011121314 Cumulative Size Distribution Curve Pulse Picture 10 20 30 12 34567891011121314 410 0012 3 45 43 2 1 1.电阻抗法原理 Histogram 2.报警信号的类型及含义 类 型 含 义 检测通道 Abn Dst 血小板分布异常 血小板 PLT Clumps 血小板聚集 白细胞分类 网织红细胞 PLT Clumps（S）血小板聚集 血小板 PLT-I Report 正常 当RBC碎片、直方图异常时 可靠性可能降低? PLT-O 3.PLT-I 和 PLT-O 转换规则 二.流式细胞仪 美国BD公司生产的FACS-Calibur流式细胞仪 1.试剂 npH7.4PBS缓冲液 n藻红蛋白标记的单克隆抗体(CD41-PE） n异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体 (CD61-FITC） 2.红细胞/血小板比率法原理 PLT-R= RBC-I/（RBC/PLT）106/L 以FCS、SSC设门 以CD61、CD41设门 以CD61、CD41对R1设门 RBC+LPLTPLT RBC+LPLT LPLT 实验方法 1.XE-2100样本检测 n用CBC+DIF+RET模式进行血常规检测 。 n实验参数： 1.RBC-I 2.PLT-I 3.PLT-O 1. 10l PBS加于Faclon管 2. 5l CD41-PE 3. 5l CD61-FITC 4. 1l EDTAK2抗凝全血 5. 混匀后放于20-25暗箱孵育15分钟 6. 500l pH7.4PBS 7. 计算出RBC/PLT-R 2. FCM检测 3.批内精密度试验 n取无血小板报警信号的三份新鲜全血样 本，血小板数分别在低值、正常值和高 值范围，分别用三种方法连续测试11次 。 4.相关性试验 nA组(20例)： no flag nB组(20例)： PLT Clumps或 PLT Clumps（S）,Abn Dst nC组(11例)： Abn Dst A组：no flag B组：PLT Clumps, Abn Dst C组：Abn Dst 结 果 1.精密度试验 批内精密度（n=8） 参数 低值 正常值 高值 （109/L） X SD CV X SD CV X SD CV PLT（I） 86 1.77 2.06 151 2.88 1.99 484 4.60 0.95 PLT（O） 90 2.44 2.71 144 3.93 2.73 445 6.19 1.38 PLT（R） 90 1.87 2.08 148 2.61 1.76 456 4.22 0.93 2.相关性试验 表3. 各光学法与比率法相关性试验结果 组别 钭率 截距 R2 P A组 1.0315 12.957 0.9846 P0.001 B组 1.1939 14.185 0.9011 P0.001 C组 1.0056 -0.7843 0.9934 P0.001 表4. 各组阻抗法与比率法相关性试验结果 组别 钭率 截距 R2 P A组 1.0774 5.1141 0.9093 P0.001 B组 1.0322 12.547 0.9599 P0.001 C组 0.7821 9.015 0.1542 P0.05 A组 B组 C组 讨 论 n由于血小板体积小，无色，易粘附，易 聚集，因此要准确计数外周血中的血小 板确非易事。 n从我们的研究结果可以看出，无警号组 阻抗法与比率法、光学法与比率法间均 有很好的相关性（P0.001）。 1.无警号组 n利用阻抗法原理计数血小板的血液分析 仪，对于形态正常的血液标本，结果比 较可靠。 n而光学法计数血小板的批内精密度要低 于阻抗法与比率法，这与文献报道一致 。 n从我们的研究结果可以看出，出现血小 板聚集警号的样本组，两方法与参考方 法间也有显著相关性。 2.出现血小板聚集警号组 n原因： 1.采用浮动界标技术，2-6 fl与1230fl 间设置浮动辨别线（LD）和（UD）。 2.可能与统计样本总体血小板数较高有关 。 外周血涂片中可见血小板聚集 3.仅出现Abn Dst警号组 n我们选择了仅出现血小板直方图异常警 号的12例样本，其血小板数均低于 60109/L，其血小板直方图显示有较多 的巨大血小板存在，其中11