免疫缺陷动物课件

免疫缺陷动物 实验动物研究中心 黄莉 1 内容： 1概念 2免疫缺陷动物的分类、特点及其应 用 3人体肿瘤裸鼠移植瘤模型概述 4人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立 5人体肿瘤免疫缺陷动物体内转移模 型的建立 2 免疫缺陷动物(Immunodeficiency animal): 由于先天性遗传突变或用人工的方法造成一种 或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 1概念 3 2 免疫缺陷动物的分类,来源,特点及其应用 （1）分类 （2）免疫缺陷动物、特点、来源及应用 4 免 疫 缺 陷 动 物 先天性的免疫缺陷动物 获得性免疫缺陷动物 T淋巴细胞功能缺陷动物（裸大鼠和裸小鼠） B淋巴细胞功能缺陷动物（性连锁性免疫缺陷小鼠， 马） NK细胞功能缺陷动物（Beige小鼠） 联合免疫缺陷动物 T、B联合免疫缺陷的SCID小鼠 T、NK细胞缺陷小鼠 T、B和NK细胞三联免疫缺乏小鼠 Motheaten小鼠 其它免疫缺陷动物（显形半肢畸形的无脾小鼠） （1）分类 5 l获得性免疫缺陷动物： l小鼠AIDS模型：SCID小鼠AIDS模型、AIDS的转基因小 鼠。 l猴AIDS模型：反转录病毒诱发、SIV诱发。 l有蹄动物病毒感染。 l黑猩猩HIV感染。 lAIDS diseases 6 AIDS diseases lAIDS When the immune system is lacking one or more of its components, the result is an immunodeficiency disorder. lThese can be inherited, acquired through infection, or produced as an inadvertent side effect of drugs such as those used to treat cancer or transplant patients. lAIDS is an immunodeficiency disorder caused by a virus that destroys helper T cells and that is harbored in macrophages as well as helper (T4) T cells. The AIDS virus splices its DNA into the DNA of the cell it infects; the cell is thereafter directed to churn out new viruses. 7 （2） 免疫缺陷动物 l T淋巴细胞功能缺陷 l裸小鼠(Nude mice): 指先天无胸腺的小鼠,简称裸小鼠 。 l 特点：11号染色体上的裸基因(nu)发生突变,导致出现 裸体异常状态。 l纯合裸基因的小鼠(nu/nu)临床表现为2个主要缺陷特征 ： l毛发缺乏呈裸体外表； l仅有胸腺上皮，使T淋巴细胞不能正常分化，导 致细胞免疫功能低下。 8 lB细胞功能正常，NK细胞活力增强。 l繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子 与雌性杂合子繁育。 lT细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞 得到恢复。 9 10 11 Hairless Guinea Pig 12 CD-1 Nude Mouse lDeveloped from the transfer of the nude gene from Crl:NU-Foxn1nu to a CD-1 mouse through a series of crosses and backcrosses beginning in 1979 at Charles River Laboratories, Wilmington, MA. The animal lacks a thymus, is unable to produce T-cells, and is therefore immunodeficient. lCOAT COLOR Hairless, albino background lRESEARCH APPLICATION tumor biology and xenograft research 13 l应用：肿瘤学,微生物学,免疫学和寄生虫学等基 础医学的研究. l微生物学的研究： 由于裸鼠的T淋巴细胞功能缺 陷,免疫机能低下,是研究病毒,微生物感染机制 的良好模型动物。 14 l免疫学研究： l研究T淋巴细胞,B淋巴细胞,NK细胞的功能； l肿瘤学研究：裸小鼠不排斥杂交瘤，腹腔内接种可 以生长肿瘤，并能生产含有高效价抗体的大量腹水 。如BALB/c裸鼠制备单克隆抗体，产生的抗体量多 于有胸腺小鼠。 15 Hybridoma Technology lA hybridoma can be produced by injecting a specific antigen into a mouse, collecting antibody- producing cells from the mouses spleen, and fusing them with long-lived cancerous immune cells. Individual hybridoma cells are cloned and tested to find those that produce the desired antibody. Their many identical daughter clones will secrete, over a long period of time, the made-to-order “monoclonal“ antibody. 16 裸鼠腹水瘤 17 l寄生虫的研究：多种寄生虫的感染研究 l如裸鼠胸腔内接种卡氏肺囊虫, 能复制出 卡氏肺囊虫疾病模型；用美洲锥虫感染(肌 肉型)裸鼠,产生美洲锥虫慢性感染模型。 18 l 临床医学研究: l外科学研究 利用裸鼠异种移植离断后神 经,观察离体后神经元的生物学性质； l眼科学研究 裸鼠眼内注射视网膜母细胞 瘤,观察瘤细胞破环视网膜的全过程; l皮肤病研究 裸鼠感染白色念珠菌,新型隐 球菌等,观察其发病机理。 19 l来源：为突变种自发无毛小鼠 l临床表现：1966年在苏格兰的一群小鼠中发现，该 鼠生长不良，繁殖力低下，易发生严重感染。 l组织病理表现：对无毛小鼠进行胸纵膈连续切片， 显示出胸腺缺失，能接受同种或异种组织移植。 目前已培育有多种遗传性无胸腺动物，如裸小 鼠、裸大鼠、裸豚鼠和遗传性无脾小鼠动物模型。 20 能接受同种或异种组织移植 人造器官培植：鼠背长人耳 21 22 l B淋巴细胞功能缺陷动物：性连锁性免疫 缺陷小鼠 （Xlinked immune deficiency mouse,XID)特点 l位于X染色体上基因缺陷导致B淋巴细胞功能缺乏 l临床常表现：血清中分泌免疫球蛋白IgG和IgM缺 失,细胞免疫功能正常.与人的Bruton氏丙种球胆 白缺乏症相似. l移植正常鼠的骨髓到xid宿主，B细胞缺失可得到 恢复。而将xid鼠的骨髓移植到受射线照射的同系 正常宿主，其仍然表现为不正常的表型。 l该小鼠用于研究B细胞的发生、功能、异质性。 23 l NK细胞功能缺陷动物Beige(bg)小鼠: l位于13号染色体上的bg隐性基因发生突变，造成 NK细胞缺乏； l该基因影响T淋巴细胞功能，同时粒细胞的趋化性 和杀菌作用降低； l该基因还影响溶酶体的功能，溶酶体功能缺陷， Beige小鼠它对各种化脓性细菌非常敏感，对各种 病原因子较敏感，SPF条件才能较好生存。 l用于研究色素缺乏易感性增高综合征。 24 l严重的联合免疫缺陷小鼠(Severe combined immunodeficient mice, SCID) l为严重的免疫缺陷疾病,动物临床表现为低球 蛋白血症、低淋巴细胞血症。 25 l来源及特点： lSCID小鼠由C57BL/Ka与BALB/cAnIcr品系小鼠杂交产 生F1代，F1代兄妹交配到F17代时，发现位于第16号 染色体的scid单个隐性基因突变所致。 lC.B-17Icr为携带来自C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重 链Igh-1b等位基因的 BALB/cAnIcr的同源近交系。 26 l血液中白细胞缺乏，所有T淋巴细胞和B淋巴 细胞功能测试均为阴性，对外源性抗原无细 胞免疫和抗体免疫反应。 l纯合子血清中无免疫球蛋白，淋巴结、胸腺 变小。饲养于SPF环境中。 l通过移植人免疫组织或免疫细胞，可使SCID 小鼠具有人类部分免疫系统，称为SCID-hu小 鼠。 27 SCID小鼠外观与普通小鼠相同，但脾脏和胸腺重 量不够正常鼠的1030%。 外周血液中白细胞总数减少，淋巴细胞占白细胞总 数的1020%，正常为70%。 28 鼠龄/周鼠数体重/g胸腺重量/mg脾脏重量/mg SCID41316.50.63.5 0.328.12.9 BALB/c41116.80.870.28.483.410.7 SCID61619.40.93.40.428.73.2 BALB/c61218.91.174.67.986.512.1 SCID81821.41.73.50.429.33.9 BALB/c81421.71.472.38.692.611.8 SCID101623.71.83.60.229.83.3 BALB/c101024.01.775.29.796.714.5 SCID和BALB/c小鼠体重、胸腺重量和脾脏重 量比较 29 鼠龄/周鼠数白细胞总数 /109.L-1 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞 SCID4122.10.30.770.840.120.2300.02 BALB/ c4107.41.10.140.260.720.8600.01 SCID6162.30.60.740.870.110.260.010.02 BALB/c6106.90.70.150.270.710.8200.03 SCID8162.60.70.760.860.140.2300.02 BALB/c8127.10.80.150.230.760.840.010.02 SCID10123.11.00.740.860.130.2600.01 BALB/c10106.80.90.120.190.800.8600.02 SCID和BALA/c小鼠外周血细胞分类比较 30 渗漏现象：少数SCID小鼠的免疫功能可出现极小程 度的恢复,把这种现象称为渗漏现象。 这种现象不遗传，但受品系，年龄和环境的影 响。有研究表明C3H-SCID小鼠的渗漏率低于CB17- SCID小鼠。SPF环境下可存活1年，采用scid小鼠基 因纯合子(scid/scid)兄妹交配进行繁殖。 31 人肺巨细胞癌PLA-801C(上)及PLA-801D ( 下)SCID小鼠移植后4周荷瘤小鼠 32 l虫蛙小鼠（Motheaten mice） 1965年发现于C57BL/6J的突变，位于第6对染色体 上的me基因发生突变，寿命不超过8周。 l出生后2天皮肤有脓肿出现,有严重的联合免疫缺陷 ，对抗原无反应，NK细胞活性低。 l纯合子(me/me) 小鼠有自身免疫倾向。用于判断生 命早期免疫功能缺陷和某种自身免疫性疾病的模型 。 lC57BL/6J-me在12日龄表皮可见嗜中性白细胞集 聚，表皮色素呈斑点状，故称虫蛙小鼠。 lthe motheaten mouse can be regarded as a genetically determined model of interstitial lung disease characterized by alveolar hemorrhage, derangement of parenchymal cells, fibrosis, and an alveolitis with distinctive features 33 lT、B和NK细胞三联免疫缺乏小鼠 人工培育的先天性免疫缺陷小鼠。将 3个隐性突变基因的3种小鼠（即NK细胞缺 陷的Beige基因,T细胞缺陷的nu基因和B细 胞缺陷Xid基因）经过杂交、回交、互交 等方法，筛选和导入育成的T、B和NK细胞 缺乏的Beige-nude-xid小鼠。 34 l 其它免疫缺陷动物（显性半肢畸形的无脾小鼠） l1号染色体显性基因Dh突变小鼠； l纯合子小鼠（Dh/Dh）泌尿、生殖和骨骼系统发生 严重畸形，出生后很快死亡。 l杂合子（Dh/+）小鼠缺乏脾脏,在一定程度上损伤 体液免疫反应。泌尿、生殖系统、消化道和骨骼有 一定程度的畸形。 l将nu基因和Dh基因结合在一起，可培育出无胸腺、 无脾脏的小鼠。 35 Comparison of Immunodeficient Strains Hair Thymus T-Cells B-CellsNK Cells Fix Complement CD-1 Nude -+ Nu/Nu Nude -+ Balb/c Nude -+ NIH-III Nude -+ Fox Chase SCID +-+ Fox Chase SCID Outbred +-+ Fox Chase SCID Beige +-+ NOD SCID +- Nude Rat -+ 36 37 3 人体肿瘤裸鼠移植瘤模型概述 （1）人体肿瘤异种移植的研究历史 （2）已建立的人体肿瘤裸鼠移植瘤模型 （3）人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特性 38 （1）人体肿瘤异种移植的研究历史 上世纪初研究发现：不同种属实验动物接受肿 瘤移植的能力是有差异的。 同种移植：鼠自发肿瘤移植于同种鼠的成功率在 98%,但在异种鼠体内不能生长。 其原因是供体与受体间的组织相容性抗原不同引起 的免疫抑制排斥。 为克服异种间的免疫排斥，研究者对降低动物免疫 功能的方法进行了多种尝试： 39 原因是供体与受体间的组织相容性抗原 不同引起的免疫抑制排斥 40 v免疫迟发部位移植：将人体肿瘤移植到免疫抑 制迟发的特殊部位（如鼠脑内,豚鼠眼前房,仓 鼠的颊部,鸡胚), 有获得成功的报道。但由于 肿瘤生长缓慢又受到移入包膜的限制，瘤块小 ，不能适应需要较多瘤源的实验治疗工作。 v降低动物免疫功能：利用注射免疫抑制剂如抗 淋巴细胞血清,抗胸腺血清；60Co或X射线照射, 在一定程度上提高了肿瘤移植成功率。但对动 物有很大的副作用，导致动物肠道受损，寿命 缩短。 41 v切除免疫组织：将新生动物的胸腺和脾脏切除, 利用免疫抑制剂注射动物的方法，或用射线照 射的方法进行不同的组合,在一定程度上破坏了 异种肿瘤移植的排斥，提高了肿瘤移植的成功 率。 42 v肾胞膜下移植：给正常小鼠肾包膜下(SRC)直接移 植人肿瘤，移植的肿瘤块可直接从血管床丰富的肾 包膜下获得营养和氧气。体式显微镜下观察6d内的 肿块变化，用于药物筛选结果与裸鼠SRC接种11天 结果相似 v无胸腺小鼠和一系列免疫缺陷小鼠的出现，人体肿 瘤在免疫缺陷动物体内异种移植的成功，为肿瘤领 域的研究带来了一场革命。 43 （2）人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立 我国目前已建立的人体肿瘤裸鼠移植模型概况（见下表） 肿瘤类型裸鼠品系模型名称模型特点建模人及单位 肺鳞癌BALB/cZPS-90皮下及胸腔移植成功 率100%，支气管移植 80% 曾宪民等（1994年）， 中山医科大学实验动物 中心 肺鳞癌BALB/cLSX-83戴志强（1988年）等， 中国科学院上海药物研 究所 肺腺癌BALB/cLAX-91具有稳定高分泌癌抗 原（CEA)的功能 汕头大学医学院肿瘤研 究所 肺腺癌BALB/cLAX-83戴志强（1988年）等， 中国科学院上海药物研 究所 肺腺癌BALB/cLTETAa-2中国科学院基础医学研 究所 44 肺腺癌BALB/cAnip-973腹腔移植形成肺及淋巴结 的转移 王吾如等(1987年),哈尔滨 医科大学病理学教研室 肺腺癌BALB/cPC-84045湛江医学院病理教研室 肺小细 胞癌 BALB/cLTEP-Sml电镜下细胞内现A-PUD颗 粒 赖百塘等(1988年),北京医 科大学病理学教研室 肺巨细 胞癌 BALB/cPG皮下接种形成肺及淋巴结 的转移 吴秉铨等(1985年),北京医 科大学病理学教研室 肺巨细 胞癌 BALB/cPLA-801D皮下接种形成肺及淋巴结 的转移。系以解放军总医 院病理科提供的人肺巨细 胞癌细胞系PLA-801D克隆 D株在裸鼠皮下连续传代 而建立 魏泓等(1996年),第三军医 大学实验动物教研室 肺巨细 胞癌 BALB/cPLA-801D- AS PLA-801D的腹水瘤模型魏泓等(1996年),第三军医 大学实验动物教研室 45 肺燕麦细胞癌BALB/cLOX-82戴志强（1988年）等，中国 科学院上海药物研究所 肝细胞性肝癌SwissLTNM1- 5(5株) 汤钊猷等(1982年,1985年 ,1986年)，上海医科大学中 山医院肝癌研究室 肝细胞性肝癌BALB/c移植瘤不仅分泌 AFP,而且还分泌 HBsAg 杨善明等(1992),厦门大学抗 癌研究中心 肝细胞性肝癌BALB/cBEL- 7402 杨善明等(1992),厦门大学抗 癌研究中心 胃中分泌管状 腺癌 BALB/c C57BL/6 SY86B皮下转代可形成转 移 李宏等(1988年),中国医科大 学肿瘤研究所 胃小弯腺癌Swiss/DFTHBGC- 1 陈诗书等(1989年)，上海第 二军医大学 胃管状腺癌BALB/cBGC- 823 皮下接种淋巴结转 移率66.7% 北京人民医院及湛江医学院 病理教研室 46 胃低分化粘液 腺癌 BALB/ c MGC-803皮下接种肺转率62.5%湛江医学院病理教研室 结肠高分化胃 癌 BALB/ c THCN- 8901 潜伏期20天,皮下移植成 功率95.7%。分泌CEA 刘洪等(1984年)，天津市 肿瘤研究所 人乙状结肠管 状腺癌 BALB/ c HCN-284潜伏期18天,皮下移植成 功率100%。分泌CEA 黄靖香等(1992年),解放军 总医院病理科 结肠癌BALB/ c XHCn/W潜伏期12天,皮下移植成 功率100%,光镜下移植瘤 可见大量印戒细胞 汪俊等(1987年)，中国医 学科学院肿瘤研究所 结肠腺癌BALB/ c 同时建立了皮下和腹腔移 植瘤株 史历等(1992年),哈尔滨医 科大学肿瘤研究所 食管鳞状细胞 癌 NC及 BALB/ c HEC2潜伏期57天,皮下接种 成功率100% 蔡海英等(1992年),中山医 科大学肿瘤研究所 食管腺鳞癌NC及 BALB/ c HEC6潜伏期610天,皮下接种 成功率100% 蔡海英等(1992年),中山医 科大学肿瘤研究所 47 低分化鳞状 细胞鼻咽癌 NC/Ng CNE-2Z移植瘤中有EB病毒基因存 在及EB病毒膜抗原与膜蛋 白表达，皮下接种淋巴结转 移 率81.5% 唐慰萍等(1989年),湛江医 学院肿瘤研究所 高分化鳞状 细胞鼻咽癌 BALB/ c CNE-1有EB病毒基因存在及EB病 毒膜抗原与膜蛋白表达 湛江医学院病理教研室 低分化鳞状 细胞鼻咽癌 BALB/ c CNE-21 低分化鳞状 细胞鼻咽癌 BALB/ c 上海医科大学肿瘤医院放 射生物室(1983年） 鼻窦(筛窦) 癌 Swiss病理中为低分化鳞癌，潜伏 期14天，皮下移植成功率 100% 李五一等(1994年),北京协 和医院耳鼻喉科 鼻窦(上颌 窦)癌 Swiss李五一等(1994年),北京协 和医院耳鼻喉科 喉癌BALB/ c LC-91王太一等,中国医科大学动 物医学部 48 脑恶性胶质瘤NC/NgSHE-44杜子威等(1984),苏州医 学院 脑星形胶质细胞瘤NC/NgNHA-8有成熟胶质微丝兰青等(1995年),苏州医 学院 脑星形一少枝混合 型胶质细胞瘤 NC/NgNHO-10有胶质微丝兰青等(1995年),苏州医 学院 脑胶质细胞瘤NC/NgNHC-9无胶质微丝兰青等(1995年),苏州医 学院 浆细胞骨髓瘤BABL/c山东医科大学 成骨肉瘤肺转移 癌BABL/c北京人民医院 Bcap-37乳腺髓样 癌 BABL/c北京人民医院 人横纹肌肉瘤BABL/c解放军总医院 宫颈鳞癌BABL/c湛江医学院病理教研室 49 随着人体肿瘤裸鼠移植瘤研究的不断深入 , 出现的问题，裸鼠移植瘤能否反应人体原 发肿瘤的全部性质？裸鼠移植瘤在基因型和 表现型上是否稳定？ l裸鼠移植瘤组织学特性 l裸鼠移植瘤性状的稳定性 l裸鼠对移植瘤的反应 3）人体肿瘤裸鼠移植瘤的生物学特性 50 l裸鼠移植瘤组织学特性： 一般情况下,人体肿瘤裸鼠移植瘤保持了原发肿瘤 的特性：如病理形态学，染色体和肿瘤标记物等 特点； l病理形态学：多数肿瘤移植后呈结节状生长，肿 瘤周围有包膜，少数可观察到远处转移和局部侵 袭； l染色体和肿瘤标记物：移植瘤经传代后仍保持人 类肿瘤细胞染色体的核型特征, 肿瘤细胞的机能 和原发肿瘤分泌特性。 51 人体肿瘤裸鼠移植瘤中产生的肿瘤分 泌活性物质及表面抗原 甲胎蛋白(AFP)及HBsAg:肝癌细胞 癌胚抗原(CEA):结肠癌细胞,人肺腺癌（裸小鼠移植瘤在 裸鼠血清中可检测CEA） 白细胞刺激因子(CSF)：肺癌,口腔癌,甲状腺癌和胆管癌 促红细胞生成素(EPO)：肾癌和肝癌 激素（HCG,ADH,ACTH,PG):肺癌和肾癌，肝癌和许多恶 性肿瘤 酶(LDH)和其它物质(黑色素):移植瘤，恶性黑色素瘤， 非何杰金氏淋巴瘤 52 l裸鼠移植瘤性状的稳定性 l不稳定性：人体肿瘤裸鼠移植瘤经过长期传代 ，表现出的基因型和表现型不稳定。 l肿瘤细胞的选择性生长：裸鼠体内的移植瘤仅 表现一种或几种肿瘤细胞亚群的选择性生长， 移植瘤中不能出现人体原发肿瘤的全部特性。 53 l表现出一定的异质性：如细胞周期时相（整 倍体细胞和非整倍体细胞） 、超微结构和 肿瘤的标记物与原发肿瘤细胞在生物学性状 上有差异。一些肿瘤移植到裸鼠后会发生某 些性状的改变，如肿瘤标记物丢失，或产生 在原肿瘤中不存在的标记物。 54 如：人肺癌移植于裸鼠，许多原肿瘤标记物丢失（ 1-抗胰蛋白酶, ACTH,铁蛋白, CEA,降钙素）； 如：肾癌移植后，除分泌红细胞生成素外，还分泌 使肝脏肿大，体液增多的物质。 因此，认识裸鼠常不能再现人体原发肿瘤全部 性状和在遗传学上的不稳定性，对合理应用实验模 型和科学分析试验结果有十分重要的意义。 55 l裸鼠对移植瘤的反应 l 人体肿瘤间质不同程度的被裸鼠间质代替：恶性肿瘤裸鼠 移植后，随着移植肿瘤的生长，裸鼠产生血管床和纤维架组 成肿瘤间质，肿瘤实质是人癌细胞增殖形成的，但人体肿瘤 裸鼠移植瘤可诱发裸鼠间质细胞发生恶变; l或移植瘤间质细胞和肿瘤细胞一样能在裸鼠体内增殖。 总之裸鼠的间质细胞受肿瘤产生化学物质影响可 发生恶变，间质又影响肿瘤细胞的分化程度，分化程 度高的见于鳞状上皮癌，分化程度低的见于腺癌。 56 4 人体肿瘤裸鼠移植瘤模型的建立 （1）繁殖和饲养 l采用隐性纯合子(nu/nu)雄性裸鼠与表现型正 常的杂合子(+/nu)雌鼠，生产表型正常的仔 鼠和裸鼠.饲养在SPF环境中 57 （2）人体肿瘤裸鼠移植方法 l根据移植肿瘤处理方式的不同分：组织块移植法 ,悬液移植法,细胞培养移植法。 组织块移植（用于建瘤株的初期） 术前准备： -眼科剪、眼科镊、手术刀柄及刀片（10号）、培养皿 、套管针、注射器（1mL)、针头（4号）、器械、纱 布、棉球打包消毒。 -消毒液擦净工作台，打开紫外灯，消毒半小时以上。 58 移植方法： -人肿瘤手术切除标本放入1640细胞培养液，或将供瘤 鼠脱颈椎处死，皮肤用1碘伏、75酒精消毒，用 手术刀切开皮肤和肿瘤，尽量取色泽肉红的肿瘤块， 于PBS液中剪成1 mm3大小,用套管针吸取2块，接种到 裸鼠的腋部,腹股沟,背部皮下或指定部位。 术后处理： -手术完毕，将供体鼠及肿瘤块包好放入污染袋，用有 消毒剂的纱布擦净操作台，用喷雾装置对室内空气喷 雾消毒。术中所用的棉签、棉球、手套及纱布等应焚 烧，器械煮沸消毒30min后，再高压灭菌处理。 59 悬液移植法： 瘤组织加入细胞培养液,用玻璃匀浆器制成悬浮液， 稀释到所需浓度（106 107 / mL），接种到一定部 位，每只0.2mL。 细胞培养移植法： 瘤细胞生长旺盛时进行移植，从培养瓶中倒出培养 液，加入胰蛋白酶消化，离心，倒掉消化液，用 Hanks清洗后，加入细胞培养液，稀释到所需浓度（ 计数106107 /mL ），进行皮下或其他指定部位注 射。 60 l根据肿瘤移植途径不同分：皮下,肌肉,腹腔, 肾包膜,原位移植等。 皮下移植：使用组织块,组织悬液或细胞培养液 均可。一般选择右侧腋下、背部、腹股沟等部位 。 肾胞膜下移植：肾包膜 下移植 早在70年代， Bogden就完成了癌细胞 肾包膜下移植试验,称为 SRCA(Subrenal capsule assay)，用12号套管针 将瘤组织接种于肾门相 对部位的肾胞膜下。 61 62 原位移植 将人肿瘤细胞移植到与肿瘤原发部位 相同的裸鼠体内，如将肝癌移植到裸鼠的肝脏。 人肝癌组织的原位移植：裸鼠(58周龄,18 20g,雌雄并用),麻醉后左侧仰位固定,消毒皮肤, 右肋沿下斜切口(1cm)，打开腹腔,暴露肝脏,切开 肝脏外膜，将患者手术新鲜无菌标本组织块移入 ，缝合。 63 结肠癌原位移植方法: 肺癌的原位移植方法: -支气管移植法(0.030.05mL) ； -肺癌瘤块肺部直接移入法: 膀胱癌的原位移植方法： 腹水瘤的建立及移植方法：0.2mL实体瘤细胞悬 液注入裸鼠腹腔，肿瘤生长后引起腹水，腹水中 含有大量肿瘤细胞,可移植传代，称腹水瘤. 腹 水瘤细胞注入皮下，可形成实体瘤。 64 （3）影响人体肿瘤裸鼠移植成功的因素 l人体肿瘤细胞本身的特征 l裸鼠免疫功能状态 l裸鼠背景 l移植部位和途径 l激素和宿主性别 l鼠龄 l其它因素 65 l人体肿瘤细胞本身的特征 人体肿瘤手术标本裸鼠移植具有一定规律， 对 381例肿瘤裸鼠移植分析后发现： 分化低的肿瘤,恶性黑色素瘤和结肠癌移植成 功率高，乳腺癌,前列腺肿瘤,造血器官肿瘤 移植成功率低； 女性生殖系统肿瘤,转移和复发性肿瘤成功率 高，生长速度快； 已建株的癌细胞在裸鼠移植成功率高于人癌 手术标本移植； 381例肿瘤裸鼠移植后，肿瘤手术标本裸鼠移 植成功率平均为28.3%(原发性肿瘤占11.5%； 复发性肿瘤为50%，转移性肿瘤38.5%)。 66 l裸鼠遗传背景和免疫功能状态 裸鼠不是没有免疫力，其体内存在较高的 NK细胞,B细胞和非依赖T细胞的免疫活性。 不同遗传背景影响肿瘤的生长：裸基因 (nu)导入不同背景品系的小鼠，产生不同 的生物学特性的裸鼠品系，如 BALB/c,CBA/N, NFS/N,NIH(S),C3H/HeN, C57BL/6N,LASA等。 67 如BALB/c， NFS/N， NIH(S)裸鼠消化 道肿瘤生长较快; BALB/c-AnN裸鼠体 内NK细胞活性比同龄的NIH(S)裸鼠NK细 胞活性低。 联合免疫缺陷小鼠提高了人体肿瘤异种 移植的成功率。 68 Immune deficient mouse strains Strain:Deficiencies SCIDT,B, (high NK) SCID/BeigeT/B/NK NudeT, B cell function low, (high NK) beige/nude/XID (bnx)T,B,NK (can be leaky) NOD/SCIDT,B,NK, macrophage (can drift) NOD/SCID/ B2M k/oT,B,NK,Macrophage - absolute deficiencies. Best model available. 4 month lifespan. Nude/NOD/SCIDT,B, NK - 2 year lifespan 69 l移植部位和途径 部位：肿瘤接种的部位不同，成功率不同。脑 内接种成功率最高；以肾包膜下接种成功率高 于皮下接种；皮下接种以近头侧的腋下接种， 成功率高。 途径：移植途径不同可影响移植瘤的生物学特 性。皮下接种一般不发生肿瘤的转移和侵袭， 而腹腔内接种较容易显示肿瘤细胞的侵袭和转 移能力。 70 裸鼠 乳腺癌（依 赖雌激素） 雌性裸鼠雄性裸鼠雌性裸鼠 卵巢切除 雌性裸鼠 卵巢切除 并用雌激 素处理 生长情况慢更慢不生长生长良好 l 激素和宿主性别 激素依赖性肿瘤(如乳腺癌,子宫肿瘤,骨瘤)在 裸鼠中难移植成功，裸鼠的性别和激素水平直接 影响裸鼠移植瘤。 71 幼年裸鼠和成年裸鼠移植肿瘤生长比较 鼠龄幼年裸鼠(3周龄)或新生裸 鼠 成年裸鼠（ 68周) 肿瘤生长情 况 明显的侵袭和高度自发性 或实验性转移 局限性生长 或低转移 l鼠龄 鼠龄对移植肿瘤生长及其转移的影响与不同龄鼠 的NK细胞活性不同有关 72 普通和洁净状况下裸鼠移植瘤生长比较 饲养环境洁净和健康裸鼠普通和肝炎阳性裸鼠 皮下或腹腔接种喉 癌(HEP-2)或结肠癌 (SW480) 可形成瘤，有皮下 肿瘤侵袭胞膜；腹 腔接种呈明显侵袭 和转移 未形成肉眼可见瘤体 ，接种细胞数量增加 ，少数成瘤，但无侵 袭和转移发生 l裸鼠健康和洁净状况 裸鼠受病毒或细菌感染，可增加抗原刺激，从 而影响NK细胞等非T淋巴细胞依赖性免疫活性，影 响移植瘤的成活及转移发生。 73 5 人体肿瘤免疫缺陷动物体内转移模型的建立 （1）免疫缺陷动物宿主及其体内肿瘤转移比较 （2）移植方法 74 l免疫缺陷动物的培育,为肿瘤转移模型的建立带 来了新的宿主动物和研究工具；其应用提高了建 立肿瘤转移模型的成功率。肿瘤转移是恶性肿瘤 患者死亡的原因 l目的： 研究机体免疫功能与肿瘤转移的关系； 通过整体观察确认肿瘤转移过程； 建立合理的肿瘤转移动物模型，有效进行肿瘤机 理研究和抗转移药物的筛选。 75 (1)免疫缺陷动物宿主及其体内肿瘤转移的比较 l无胸腺裸鼠 lT、NK细胞缺陷的Beige-nude小鼠 lT、B细胞缺陷的Scid小鼠 lT、B、NK细胞三联免疫缺陷小鼠 76 l无胸腺裸鼠 大多数人类恶性肿瘤在裸鼠建立了移植瘤,但在裸 鼠体内建立的人类恶性肿瘤裸鼠转移瘤还很少,转 移瘤的建立具有一定偶然性。 经皮下移植的人恶性肿瘤(手术标本,培养细胞)均 表现不转移和转移力低,仅在皮下形成局限性肿瘤 ,不易扩散。 因此，无胸腺裸鼠皮下移植瘤模型在肿瘤转移研 究中具有局限性。 77 lT、NK细胞缺陷的Beige-nude小鼠 在裸鼠体内难移植成功的人T淋巴细胞性白血 病细胞系(CEM)移植到Beige-nude体内，建立 了肿瘤移植模型,但移植瘤在皮下仅呈现局限 性生长; 将裸鼠体内形成低转移和不转移的