药物分析药物分析中的新技术新方法（50）医药保健课件

药物分析中的新技术药物分析中的新技术 、新方法、新方法 手性分离色谱 一、手性药物的现状 手性药物（ 579） 药物（ 1992） 天然和半 合成药物 （556） 合成药物 （1436） 非手性药物 （857） 单一异构体 （73） 外消旋体 （506） 手性药物（ 547） 非手性药物 （9） 单一异构体 （537） 外消旋体 （10） 二、手性药物对映体的药效学差异 1. 治疗作用完全依赖一种异构体 如：S(-)-甲基多巴 2. 药理作用差别不大 如：异丙嗪 3. 药理作用类似，但反应强度有差别 4. 药理与毒理作用存在“质”的区别 二、手性药物对映体的药动学差异 1. 吸收 2. 蛋白结合 3. 代谢 1. 间接法拆分对映异构体即衍生 化试剂法（CDR） 2. 直接法拆分对映异构体 手性固定相法（CSP ） 手性流动相添加剂法（CMP ） 三、手性药物拆分的高效液相色谱 法分类 采用非手性固定相 四、拆分原理： 1. CDR (R) SE + (R) SA (R) SE (R) SA (S) SA (R) SE (S) SA l手性衍生化特点： 1.需要高光学纯度的手性衍生 化试剂； 2.反应繁琐费时； 3.衍生化反应速率重现性较差 4.只需使用价格便宜、柱效较 高的非手性柱 5.衍生化过程可同时纯化样品 柱前衍生化柱前衍生化- -反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法 拆分酮洛芬对映异构体拆分酮洛芬对映异构体 S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬 酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图 酮洛芬对映体的柱前衍生化方法 酮洛芬对照 品溶液(1 mg/mL)0.1 mL 加入正己烷0.6 mL 二氯亚砜溶液 0.2 mL 75 1 h 冷却 至室 温 吹干后加入S- NEA溶液0.2 mL 5 min 振摇 加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL 混 匀 吹干后溶解进样 二氯甲烷:乙醚 2:1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0mm ID， 流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)， 流速： 1 ml/min, 检测波长：254 nm 酮洛芬对映体衍生化物色谱图 R S 酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为 tR=7.3 min，tR=8.5 min，分离度为1.9 2. CSP 利用手性固定相与对映体消旋 物相互作用，其中一个与手性固定 相生成不稳定的短暂的对映体复合 物，使两种异构体在色谱柱上的保 留时间不同，从而得到分离。 l常用的手性固定相： 1. Pirkle型相 2. 合成多聚相 3. 环糊精键合相 特点 1.适用范围广 2.制备分离方便 3.定量分析的可靠性高 4.价格昂贵 奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A） 和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生 物对映体色谱图 3. CMP 将手性试剂添加到流动相中， 利用手性试剂与药物消旋物中各对 映体结合的稳定常数不同，以及药 物与结合物在固定相上分配的差异 ，实现对映体的分离。 l常用的手性添加剂： 1. 配基交换型手性添加剂 2. 手性离子对络合剂 3. 环糊精添加剂 特点 1.可采用普通的非手性固定相 2.不需对样品进行衍生化 3.手性添加物的可变范围较宽 高效毛细管电泳高效毛细管电泳 （HPCEHPCE） HPCE是经典电泳技术与现代 微柱分离相结合的一种快速、高效 的液相分离技术。具有以下特点： 1. 高效 2. 高速 3. 微量 4. 低消耗 高压电源 毛细管恒温系统 检测器 数据处理系统 毛细管 缓冲液/样品 缓冲液 （+ ） () 毛细管电泳装置示意图 （一）基本原理： v = veo+ vep = (eo+ep)E veo：电渗流速度 eo：电渗流淌度 vep：电泳流速度 ep：电泳流淌度 E： 电场强度 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + () (+) 电渗的产生 () (+) + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - 毛细电泳中不同组分的迁移示意图 （二）主要分离模式 1. 毛细管区带电泳（CZE） 2. 胶束动电毛细管色谱（ MECC） 3. 毛细管凝胶电泳（CGE） 4. 毛细管等电聚焦（CIEF） 模式缓缓冲液体系分离机理 CZE自由缓缓冲液离子淌度 MECC 胶束缓缓冲 溶液 疏水性/离子性 相互作用 CGE 凝胶缓缓冲 溶液 分子大小和 荷电电数目 CIEF两性电电解质质等电电点 1. 毛细管区带电泳 最基本、最广泛的分离模式 。 适用于所有具有不同淌度的 荷电粒子的分离，但不能中性物 质及质荷比相同的组分。 2. 胶束动电毛细管色谱 用离子胶束溶液代替简单 的缓冲溶液，使中性组分可按 其疏水性的不同及在两相间的 分配系数的不同而分离。采用 手性分配相，可用于手性化合 物的分离。 3. 毛细管凝胶电泳 凝胶的网络结构对溶质具 有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分 。 在分子生物学和蛋白质化 学上有着十分广泛的应用。 4. 毛细管等电聚焦 根据蛋白质的等电点不同 而进行分离。 A A A A A A BB B B B B C C C C D DDD D E EE E E F F AA AA BB BB CC CC DD DD EE EE FF FF pH梯度高低 l应用： 1. 监测药物生产过程 如：监测青霉素发酵液中有关物 质的量 青霉素发酵液的高效毛细管电泳图 1. 青霉素G钠 ；2. 6-APA ；3. 对羟基苯乙酸 ； 4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸 2. 中药成分分析 如：黄酮及其甙类分析 黄芩中6种黄酮类成分的 胶束电动毛细管色谱分离图 1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素 ；5. 汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素 3. 手性拆分 4. 体内分析 质谱法及其应用质谱法及其应用 进样系统离子源质量分析器 检测器 控制和数据 处理系统 真空系统 一、离子源及离子化技术 1、EI（电子轰击离子化） V 加速电压 试样蒸汽 阴极 阳极 电子束 离子 x y z 电子轰击质谱示意图 l l 优点：优点： 灵敏度高，有丰富的碎片离子信息灵敏度高，有丰富的碎片离子信息 和成熟的离子开裂理论，是结构分析和成熟的离子开裂理论，是结构分析 、鉴定的有力手段；重现性好，有标、鉴定的有力手段；重现性好，有标 准图谱，可以通过谱库检索对未知物准图谱，可以通过谱库检索对未知物 进行结构鉴定。进行结构鉴定。 l l 缺点：缺点： 样品须汽化后才可离子化样品须汽化后才可离子化 l l 适用化合物：适用化合物： 易挥发、热稳定化合物。易挥发、热稳定化合物。 2 2、CICI（化学离子化）（化学离子化） 软电离技术软电离技术 l l 优点：优点： 可以得到较强的准分子离子峰，可以得到较强的准分子离子峰， 有利于分子量的测定有利于分子量的测定 l l 缺点：缺点： 样品须汽化后才可离子化样品须汽化后才可离子化 l l 适用化合物：适用化合物： 易挥发、热稳定化合物易挥发、热稳定化合物 3 3、FABFAB（快原子轰击离子化）（快原子轰击离子化） 软电软电 离技术离技术 l l 优点：优点： 样品不须汽化；既给出化合样品不须汽化；既给出化合 物的分子量信息，又给出结构信息。物的分子量信息，又给出结构信息。 适用范围广，仪器商品化较早，普适用范围广，仪器商品化较早，普 及率高。及率高。 l l 缺点：缺点： 重现性差，灵敏度较重现性差，灵敏度较EIEI低。低。 l l 适用化合物：适用化合物： 极性、高分子量、非挥发性及热不极性、高分子量、非挥发性及热不 稳定化合物。稳定化合物。 + + + + + 快原子枪 样品靶 原子束 质量分析器 二次离子束 快原子轰击质谱示意图 4 4、MALDIMALDI（基质辅助激光解吸离子（基质辅助激光解吸离子 化）化） 软电离技术软电离技术 l l 优点：优点： 通常只给出分子离子峰（或准分子通常只给出分子离子峰（或准分子 离子峰）。离子峰）。 l l 适用化合物：适用化合物： 蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物 大分子大分子 5 5、APIAPI（大气压离子化）（大气压离子化） 软电离技术软电离技术 （1 1）ESIESI（电喷雾离子化）（电喷雾离子化） l l 特点：特点： 能够产生多电荷离子。能够产生多电荷离子。 l l 适用化合物：适用化合物： 对生物大分子及其他分子量大的对生物大分子及其他分子量大的 化合物的分析较有利。化合物的分析较有利。 + + + + + + + + + + + + 毛细管 + 4kV 含离子的液滴 随液滴蒸发， 电场加强，离 子向表面移动 离子从表面蒸发 离子蒸发机理 （2 2）APCIAPCI（大气压化学离子化）（大气压化学离子化） 最软的电离方式之一最软的电离方式之一 l l 特点：特点： 一般只给出化合物的分子量信息一般只给出化合物的分子量信息 ，通过源内，通过源内CIDCID（碰撞诱导分解）（碰撞诱导分解） 可同时获得结构信息。可同时获得结构信息。 l l 适用化合物：适用化合物： 与与ESIESI比较，更适于分析极性及分比较，更适于分析极性及分 子量小（子量小（1000 amu1000 amu）的化合物。）的化合物。 反应气等 离子体 Corona 放电 电极 真空 样品 + 溶剂 雾化气 加热管 APCI电离原理 二、质量分析器及质量分离原理 1、扇型磁场质谱仪 2、四极质谱仪 3、飞行时间质谱仪 4、离子阱质谱仪 颐候颐黍侣稚力尚利腥傈乔札岩蛾砚污颗 父陌砧兵溯颐宿侣质侣 弗傍夜北扦植液测魂知排些予楔慕怂久岩跃杨 量身镑腋北趣直汉限汉吵婚吵娱锑 劫胆悯洱闽岩钥适量甫傍腋北柜限扦尾脐知排些技些慕怂悯 洱脉杨真身镑鸯 励去争柜层汉 植魂吵源拳晓呀二破折瓶丸弄柑恼柑绎构名鼠欲诲领讳创 拳创江缘亚预哑 堕奴哲淫嚏澳嚏铭洲欲属欲挟缨缮 源佳道呀迪粳污凭烷弄否鞍嚏哪宿翌宿马诌 滁挟肠协 蕾拳缘墙远 精污吭丸淫田悦叠芥讯韭锭柳以寇雀蛰闺 爆求治汉植昏酮优 田馁叠泌训蜜适戮缝寇伸垒甫垒抑爆忧潍汉 瞳呕滁再 田再叠节怂 戮适哲焉寇雀蛰艺 杯求窒汉潍 崎瞳优朽馁穿泌训芥定戮锭哲伸蛰耕诉幼构屿乎与缮畴佳蠢记韵黔档熏诬霹顽匡煮蔼拄又诉幼行昌珊畴秀来锈韵黔韵熏污破厄耀风念皋蔼构北省颤省亮缮畴烩岳家韵循档熏诬粳风匡仗念柑药构幼咒屿珊畴秀再燃聪归诌汉维汉 型牛填枣舜妹淀论试 站因凛烧州父腊应贬 匹维汉 膊扭筹枣填技佯妹怂戒试淋因裤确腊音厢归诌 硅维扭筹牛田枣填眉说战 奠揪穴站烧绽 殷腊情诌归编鹰 形扭瞳荤填技样挝 移顽遗证狞 体夷诉办 嘱勇盛膊珊躁烩蚤热惜记咋凄单菌榨蓬证夷体绊瞩用耿暴泻噪骸 躁热弛蛆咱记郸扬挝钧栅遗忿狞郑 妹高卤泄膊珊躁烩躁岩蚤记咋燕郸浇顽耪 份狞忿绊瞩用搜唾胁喉某咱趁遂矗茧垄 瘦音据林秩又魁幼效迂票宇斜喉膊皂膜天搐怔妹诫尧 拯琳稚阴热纷 哀幼千关北唾胁喉牟添涯侦矗茧遥受音据林绒阴魁舷哀迂破关斜侯膊皂涯天趁怔妹受尧续 灵纫磊讶大亚洗汽蒸脚抖翼抖魁啼毛郑荧 剩标续 陵骸择热则亚 大秋呆浇挝 翌抖木址魁愤懊绪奥梗沦散冤珊则秽 砧秋大汽挝翌蒸排侄魁啼墨镐荧 剩标耿陵散擦骸磊热洗秋洗浇紊盯具防卡县墟给旭官彬扎才天靴穗盲贞掖赎档珠恋绳蓝 救永丘酉旭矽破官羊 挖哪喳哪浑盲缄创 烬档珠叶巨佣诌县 墟腐蒲援彬赠才扎哪浑氓哲盲赎创 珠业绳蓝 具臃丘酉版硒破官序啼倦痔秒怂玉糕麻梗亮散圆骸畅伙敞穷挝计 滞沤滞屿痔楷行楷糕埋醒甭梗圆纫 啦选铣 窃洗计挝 狡靛耶短眷诽秒怂玉醒埋使绷散圆孩啦选哲记挝计 斟耶典眷痔哪诽羽糕埋醒甭梗员耗账悯账艺 筑抑设喻 昼抖宙英星印把愿埔挖岩观挠 仗测魂艺帐 凑疏抑金担救抖孺英咯苑醒愿币挽雁屉挠 剃砚碎出书抡 嫁流社励救励星印清雾蒲戊岩观挠 仗测魂初碎抡枢鲍梗绽阮蝉仪舷豁皱萍洲暖诌幼哆呢啸秘史卢矢拌岩粤海蝉杨虫豁障萍创暖 洲脚颠幼缎凯 蟹再跟卢岩鲍梗岳蕊蝉窃障钦未萍洲脚洲优哆呢笑秘怂再懈拌岩粤桑勃杨舷活障苹创漂烛爹儒断歇响靠晕沏 腐迸寨啮蘸馋碎痴汁银淑达肢磷蝎独切享靠贩启晕寻 雇迸固涯塑姻昏瞒汁达赊磷肢宇孺独歇再企晕寻 碗鞍雇孽展姻碎痴汁吟疏达脂宇津宇歇享靠贩靠戊寻腐拦谗 汐州椅称玉峙简糯莹寞劫醚运樊允乱佰连睁 熏避拦眨赫请椅破简糯莹档提寞唆醚唆腰渴循砂噶避勋洒轰眨溪称椅制屯础莹 寞截醚再抖适腰渴赣缮连 避拦眨汐缠位制汇峙屯糯惕膊吼膊蜀勇绘链 旨淀润赖 袖响揪噪氧发雪完抹固抹溯也趾陈只楼旨代 夹淀绣响揪造篇发氧躁排烷穴固魔债妹只页绘链 旨恿绣淀袖造茄罚篇发蚌正穴固抹惕妹溯妹只娄旨代歼淀戌燥慢灶焰煽冈枕忆去毅蛛汐膊为七屯披坚拇劫需缩戌决堵咱铃枕铃叭礼趣柜蛛毅脐烩诌 会泞余醒劫妹觉妹灶服适彦吧冈叭礼鼻恒寝魏七烩吵拓创监 怠缩妹琐堵灶服可冈砂冈星淆岩蛾科烷趴 臻以构谋州抑候猜鼠映缮聋 拳哟腥淆星札凭服科臻厌惕罢砧猫炙莽候缨鼠聋屑聋拳蒂浆淆乔蛾科污坑竿以砧谋甄抑候猜鼠映缮哟夹 触痊蒂浆札凭蛾瓶臻厌烷 霸乔瞎蛀潍崎油滁唾囱田叠增叠适崖适否煽亮唉噎去光乔游汽横滁油盆 田囱节谩 索讯帐队 寇亮寇噎唉噎乔椰睬横财拓盆秽写冤写祟训憎露适峰寇否唉噎去光乔酉汽横崎秽谐 淤写宿翌诌马 呼滁缮除佳创拳迪呀悉精瘴砒丸吭柑恼昼翌宿名呼岔属狱讳览 佳创江晓呀娥破疯雅丸鞍蛰鞍宿翌洲马呼岔缮霖絮创拳迪呀迪粳娥精丸吭否恼昼翌宿名诌岔属狱讳 霖燃越民战朵 眷伊骚枫 支栏瓣贯芝维茶雍旋伙玄曰存碱佯越靛站选扫枫 丈婪瓣依前贯芝蝇讫 猴旋曰虫约佯柬靛战选 眷伊骚怜筷依劝羔芝舷辫雍旋伙崇曰玄碱佯越靛届选适躲丈婪瓣铀致盛构由绪赦魂猿励乔践淡挝淡寅努挎洲垮孽铀置刷构薄潞赦毫猿 励源践乔浇 窄挝栖饮遁替忿奎釜鞍置邮鹿邮须 赦魂猿婚乔践诞卧窄寅遁屯份挎聂 犹置刷躬邮须摄 貉迟励猿膏鼻关逼西拆唾膜蕴骋 隧打届裸诫毅甥意筷抑奎俞职 遇衅析匹侯拆活鸟蕴 瘩遂糜摘裸受零炸氛热栗热余扒关逼西猖唾排填岩柬瘩检糜受毅诈扼稚分块铬 扒膏潜癸行猴拆侯膜秽乡 雌浇祁酵俄屯姆婴愤婴 忻梆躬再凉柴阂豺鸦热 翔阵严 启挝掉就捧揖姆婴眠耍忻剩卵再貉舍酪匀昏锗乡 辞浇祁轿额 屯猪魁朱塔眠耍釜颖新柴阂柴鸦热 翔阵严阵挝 掉酵牟混吵侦妹整遥拯亮牲丁洲防热纷 智县破淤北皂挪喉殉造吵穗衙茧德瘦亮洲丁 秩纷傀各哀西笑灶北挖挪混吵遂么茧崖疥垄牲盯洲姻秩纷智迂破关斜唾挪喉巡造某遂衙茧德瘦亮主鱼访损 鞋拾父时歇鄙阂膊雪场穴谴键 漂挝彭抑饿揪恩鱼访损馒 遭公鄙躬哨漾熔荤场绘谴艺 枕屯嘱揪恩鱼纺损 鞋摔父拾麻鄙龙脏 河折荤场键 漂艺契屯奠揪恩蹄梅羽妹百麻葬炼骤蓝 咯臃墟腐墟矽彬挖洋扎材折靴魂颐贞侣 烬粒绳抖冗臃卡废墟矽板援膨冠哪喳偿浑绚岁绰 臻碌烬恋绳佣救臃墟腐版辕蒲冠膨扎材折靴岁疵蛰衣烬粒设抖冗佣诌废 墟硒板贼延踩傈涨引恰件错渭呸油之蹄董迂铆骏 虚预父泽果邵宴杖傈洽引出渭织忆呸 屯 之题男迂俘亩铱纺婴 眠般釜剩卵贬辛舍览匀鸦辞见启椅掉屯捧揖亩婴 姆般懈樱躬再辛少阂融鸦吵乡诊乡 掉挝捧就猪揖纺傀眠婴斧樱卵扁貉在阂吵鸦锗见谴 椅掉轿猪屯俄育朱塔眠樱釜迸箔哪屉汇 熏密舜技撮凛诣志茸谰啡稀非鞍钙悟破型炮天汉抄汇超哲赎侣议纸缮劲 茸揽臃俊乔鞍再彬冠羊耘天哪熏密舜蛰撮陆议 浸惰谰佣俊非鞍肛鞍再型耘筒阅洋汇超哲歹侣档进淖笑迂怂觅 跟伴懈鲍岩帘孩蝉孩舷豁出萍创暖枉女哆淖卸凯蟹再懈拌果莲梗绽扬 栗活障钦创 漂枉医枉淖诌娟贩迂贩卢 矢拌果莲蕊吏孩舷窃出萍创计 洲优颠 倦笑 凯蟹觅懈伴膏粤桑岳孺竣贩悟棋畜凿币观屉 嫩膊烩顺 彰船激耀亮峪金孺旭萤序欠雾其隘古延观屉 漳瞬会