实验三_质粒dna的提取与酶切课件

紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNADNA 实 验 三 重组质粒重组质粒DNADNA的提取、酶切鉴定及电泳检测的提取、酶切鉴定及电泳检测 实验安排实验安排 n n 上午：上午： 质粒质粒DNADNA提取提取 限制性内切酶酶切鉴定限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶制备 n n 下午：下午： 酶切产物的电泳酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNADNA 实验课题设计的要求与安排实验课题设计的要求与安排 1 1 提取质粒提取质粒DNADNA和提取基因组和提取基因组DNADNA有何不同有何不同? ? 2 2 限制性内切酶与医学有何关系限制性内切酶与医学有何关系? ? 3 3 可以有哪些技术或方法检测生物样品中可以有哪些技术或方法检测生物样品中 的核酸或蛋白质的含量的核酸或蛋白质的含量? ? 问问 题题 1 1 设备操作注意点设备操作注意点 1)1) 752752型型 分光光度计的使用分光光度计的使用 预热预热 调零调零 对照对照 重复重复 2) 2) 比色杯的使用比色杯的使用 注注 意意 点点 容量容量 清洁清洁 安全安全 2 2 试剂使用注意点试剂使用注意点 限制性内切酶的使用限制性内切酶的使用: : 低稳操作低稳操作; ; 取量准确取量准确; 37 C; 37 C孵育孵育 3 实验课题设计的要求与安排实验课题设计的要求与安排 2-32-3人一组人一组, , 每组每组pptppt报告报告8-108-10分钟分钟, ,老师提问老师提问3-53-5分钟分钟 . . 第一部分：重组质粒第一部分：重组质粒DNADNA提取提取 1 实验步骤： 加1.5ml培养物于EP管，12000rpm30s 去上清（除净），加入150l 150l 溶液溶液I I，充分重悬 加入200l 200l 溶液溶液IIII，立即、轻柔立即、轻柔振荡数次 加入150l 150l 冰溶液冰溶液IIIIII，震荡10s，冰浴35min， 12000rpm10min 裂解细菌、释放质粒裂解细菌、释放质粒DNADNA 转移上清转移上清到新EP管，加入1/2体积酚酚 加入1/2体积的氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇 （共约450l）（酚/氯仿/异戊醇 -25/24/1） 振荡混匀，离心12000rpm5min 转移上清转移上清到新EP管， 加入等体积氯仿：异戊醇（共约450l） 振荡混匀，离心12000rpm5min 除去杂质、纯化质粒除去杂质、纯化质粒DNADNA 转移上清转移上清到新EP管 加入2倍体积95%乙醇（约800l）混匀，静置5分钟以上 离心12000rpm15min 弃上清弃上清， 100 l 75%乙醇洗沉淀，12000rpm2min 弃上清弃上清，静置干燥，0.1TE 20 l 溶解DNA 酶切鉴定（16 l） 质粒质粒 (plasmid)(plasmid) 质粒是存在于细菌体内的一 类 独立于染色体的自主复制 的遗传成分，在细胞内它们常 以共价闭环的超螺旋形式存在 。 质粒已成为目前最常用的基 因克隆的载体分子。有一 些质粒能携带外源DNA，可以 作为目的基因进入受体细胞的 运载工具。 质粒是细菌内的共生型遗传因子，质粒是细菌内的共生型遗传因子， 有相对独立性。有相对独立性。 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主 细胞一些表型。细胞一些表型。 它是双链闭合环状它是双链闭合环状DNADNA，分子量大分子量大 小不等。小不等。 2 2 实验原理：实验原理： 分离纯化质粒DNA 的三个主要步骤： 培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增 细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 质粒质粒DNADNA的纯化的纯化 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNA分分 子相对较小及共价闭合环状的性质。子相对较小及共价闭合环状的性质。 碱法抽提质粒的主要试剂的作用原理 溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisClCl组成组成. . 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少 抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒 。 EDTA EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离的作用是络合掉镁等二价金属离 子，防止子，防止DNADNA酶对质粒分子的降解作用。酶对质粒分子的降解作用。 TrisTrisClCl能使溶菌液维持溶菌作用的最能使溶菌液维持溶菌作用的最 适适PHPH范围。范围。 溶液溶液：SDSSDS、NaOHNaOH SDSSDS的作用：解聚核蛋白、并与蛋白质结合使之的作用：解聚核蛋白、并与蛋白质结合使之 变性；变性； NaOHNaOH的作用：破碎细胞，使的作用：破碎细胞，使DNADNA分子变性。分子变性。 溶液溶液：KAcKAc、HAcHAc H H+ + 中和溶液中和溶液的的OHOH - - K K+ + 可与可与SDSSDS中的中的NaNa + + 发生置换，生成发生置换，生成PDSPDS（白色（白色 沉淀），与蛋白质和染色体沉淀），与蛋白质和染色体DNADNA共沉淀共沉淀 n n 用用RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA， n n 用酚抽提法除去残留的蛋白质。用酚抽提法除去残留的蛋白质。 质粒质粒DNADNA的进一步纯化：的进一步纯化： n n 小分子的质粒小分子的质粒DNADNA呈天然构型，溶解在呈天然构型，溶解在bufferbuffer中。中。 n n 通过离心可以把沉淀（染色体通过离心可以把沉淀（染色体DNADNA、蛋白质、蛋白质-PDS-PDS复复 合物等）一起除去。合物等）一起除去。 溶液溶液、处理之后：处理之后： 质粒的三种构型：质粒的三种构型： n闭合环状DNA n开环DNA如果两条链中有一条发生 一处或多处断裂，分子因旋转而消除链 的张力。 n线状DNA如果两条链均断开，即为 线状DNA。 3 3 注意点：注意点： n提取的DNA不纯，含有其它杂质（蛋白、多糖 ） 变性不充分； 关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 n提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 n混有染色体DNA： 变性过程不完全， 试剂配置有问题。 第二部分：酶切鉴定（双酶切） 重组质粒 BamBamH H I I HinHind IIId III 反应体系（反应体系（20l20l） 试剂或样品用量（l） BamH I1 Hind III1 10buffer2 pUC119-U616 母液，再分装 4l/4l/人人 n n 分分3 3大组，每组约大组，每组约10-1210-12人人 n n 每大组配置一份每大组配置一份“ “母液母液” ” n n 混匀混匀“ “母液母液” ”，分装（，分装（4 4 ll/ /人）人） n n 每人将酶切底物（质粒）与反应体系（分装每人将酶切底物（质粒）与反应体系（分装 的的“ “母液母液” ”）混合）混合 n n 充分混匀，瞬时离心充分混匀，瞬时离心 n n 3737CC，1-31-3小小时时时时 n n 电电电电泳泳检测检测检测检测 2.目的基因 和质粒载体 的连接 3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择 5.目的基因表达 1.目的基因的获取 DNADNA片段（目的基因）与载体片段（目的基因）与载体DNADNA分子相连接，形分子相连接，形 成重组成重组DNADNA 选出含有所需要的重组体选出含有所需要的重组体DNADNA分子分子的受体细胞的受体细胞 目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质) ) 重组DNA技术的一般过程 n基因克隆示意图 宿主基因组 大肠杆菌 + 重组质粒 基因工程诞生的技术突破 n n 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction enzymesrestriction enzymes） 1970年H. O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 。 Werner Arber 理论预见限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 1978年Nobel生理或医学奖 限制性核酸内切酶 n是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列（48bp），并由 此处切割DNA双链的核酸内切酶 n来源：原核生物 n功能：自我保护细菌的限制和修 饰系统（R/M体系） pUC119物理图谱 重组质粒 BamH I Hind III 双酶切 电泳检测 5-G G A T C C-3 3-C C T A G G-5 BamH I 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III 质粒酶切电泳结果分析与小结： M：Marker 1：酶切样品1 2：酶切样品2 3：酶切样品3 4：未酶切质粒 M321 1Kb 200bp 100bp 2Kb 5Kb 600bp 400bp 4 一般的重组质粒酶切结果电泳图 第三部分 紫外分光光度计检测DNA n n 特点特点 灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达1010 5 5 1010 6 6 mol/L, mol/L, 准确度能够满足微量组分的测定要求准确度能够满足微量组分的测定要求 ： 相对误差相对误差2 25 5 操作简便快速操作简便快速 应用广泛应用广泛 吸光光度法是基于被测物质的分子对光吸光光度法是基于被测物质的分子对光 具有具有选择性吸收选择性吸收的特性而建立起来的分析的特性而建立起来的分析 方法。方法。 光学光谱区光学光谱区 远远远远紫外紫外近紫外近紫外可可见见见见近近红红红红外外中中红红红红外外 远红远红远红远红 外外 （真空紫）（真空紫） 10nm10nm 200nm200nm 200nm 200nm 380nm380nm 380nm380nm 780nm 780nm 780 nm780 nm 2.5 2.5 mm 2.5 2.5 mm 50 50 mm 50 50 mm 300 300 mm 氢氢氢氢灯灯 复合光复合光 （阳光及（阳光及钨钨钨钨灯）灯） 发发发发射光射光谱谱谱谱 红红红红 橙橙 黄黄 绿绿绿绿 青青 蓝蓝蓝蓝 紫紫 单单单单色光色光 三棱三棱镜镜镜镜 可可见见见见光分光光度光分光光度计计计计光源光源 紫外分光光度紫外分光光度计计计计光源光源 光学原理 吸收光吸收光谱谱谱谱 在光源和棱在光源和棱镜镜镜镜之之间间间间放上某种物放上某种物质质质质的溶液，的溶液， 光源光源发发发发射光射光谱谱谱谱中某些波中某些波长长长长的光因溶液吸收的光因溶液吸收 而消失，而消失，这这这这种被溶液吸收后的光种被溶液吸收后的光谱谱谱谱称称为该为该为该为该 溶液的溶液的吸收光吸收光谱谱谱谱。 苯和甲苯在环环己烷烷中的吸收光谱谱 苯 (254nm) 甲苯 (262nm) A 230 250 270 Lambert-Beer定律 A或DK C L 吸光度 摩尔消光系数 吸收物质质的光径（cm） 溶液浓浓度（mol/L） 浓度dsDNA（单位为g /ml） =50(OD260) 稀释倍数 1. 用TE适当稀释待测DNA溶液，记下稀释倍数; 2. TE作为空白，“调0”，“调100”。 注意：先选定波长260nm或280nm。 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNADNA实验操作实验操作 3.测定260nm 的吸收值。 260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度 4. 测定280nm的吸收值。 可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（ OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品 ，其比值为1.8。低于此值可能有蛋白质或其它杂质 的污染；高于此值说明有RNA污染。 第四部分 分子医学分子医学 实验设计实验设计 一、一、分子医学分子医学实验设计实验设计 理解所学的实验方法和技术理解所学的实验方法和技术 能运用能运用基本基本的实验方法和技术进的实验方法和技术进 行行简单简单的科学研究的科学研究 二、实验设计的基本内容二、实验设计的基本内容 实验目的与意义（为什么做？）实验目的与意义（为什么做？） 实验材料、试剂和仪器（用什么做？实验材料、试剂和仪器（用什么做？ ） 实验方法和步骤（怎样做？）实验方法和步骤（怎样做？） 实验指标（看什么？）实验指标（看什么？） 实验预期结果与分析（如何评价）实验预期结果与分析（如何评价） 举举 例例 题目：肝癌患者和正常人血清蛋白质分布的初步比较 1.研究目的与意义 通过比较肝癌患者和正常人血清中蛋白质的种类与 数量的不同，了解肝癌患者血清中出现的异常蛋白 和正常蛋白质的改变，初步探讨这种改变对肝癌诊 断和判断病情的作用。 2.材料、试剂与仪器 标本：正常人血清、不同病程肝癌患者血清（早、 中、晚期）、蛋白质标准对照 试剂：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂 仪器与设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、 烧杯、吸管、微量移液器 3.实验方法和步骤 方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 步骤： 试剂准备 制胶 样品处理 电泳 染色与脱色 4.实验观察指标 聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带的分布 电泳区带颜色深浅 5.实验预期结果的描述