流式细胞分析在临床血液学中的应用课件

流式细胞分析在临 床血液学中的应用 西南医院检验科 黄君富 1Keylab of Medicine School of Su Zhou University 1、白血病免疫分型 vFAB主要依据形态学和细胞化学进行分型。 vMIC方案在FAB方案基础上结合了免疫学和细 胞遗传学。（M：形态学 I：免疫学 C：细 胞遗传学） 2Keylab of Medicine School of Su Zhou University 免疫分型与FAB的关系 vFAB分型受检查者的主观因素影响大，符合 率有一定限制。 v免疫标志能够提供正常细胞在演变成恶性肿 瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信 息，而这种变化常常是细微的，以至于常规 FAB方法不能分辨。 v免疫分型是MIC的重要组成部分，它是对FAB 分型的补充。 3Keylab of Medicine School of Su Zhou University v属于同一种FAB型的病例，可能具有不同的 免疫表型。 v免疫表型在AML和ALL上与FAB的不一致并不 减低免疫分型在白血病患者的应用价值，相 反，免疫表型使我们对血液肿瘤细胞的生物 学特征有了更深入和更精确的认识。 v免疫表型对肿瘤的诊断、治疗策略的制定、 预后判断及肿瘤发病机制的研究都具有重要 作用。 4Keylab of Medicine School of Su Zhou University 免疫分型的两个阶段 v根据白血病细胞表达的系列相关抗原， 确定其系列来源。如：淋系T/B、粒单系 、红系、巨核系等。 v根据白血病细胞表达的系列分化其相关 抗原进一步分型。如：早前B，前B，普 通B 5Keylab of Medicine School of Su Zhou University 急性白血病的四大免疫类型 v单表型急性白血病 v表达某一个系列抗原为主的急性白血病 v双表型/双克隆急性白血病 v未分化型急性白血病 6Keylab of Medicine School of Su Zhou University 急性白血病的免疫学系列分型 类 型 系 列 积 分 B系 T系 粒单系 巨核系 红系 1.单表型 纯B-ALL 2 0 0 0 0 纯T-ALL 0 2 0 0 0 纯AML 0 0 2 0 0 纯AML-M6 0 0 2 2 2 纯AML-M7 0 0 2 2 2 7Keylab of Medicine School of Su Zhou University 急性白血病的免疫学系列分型 类 型 系 列 积 分 B系 T系 粒单系 巨核系 红系 2.单表型为主 My+B-ALL 2 0 2 0 0 My+T-ALL 0 2 2 0 0 Ly+AML 2 2 2 2 2 T+B-ALL 2 2 0 0 0 注: My+ : 髓系抗原阳性;Ly+:淋系抗原阳性 8Keylab of Medicine School of Su Zhou University 急性白血病的免疫学系列分型 类 型 系 列 积 分 B系 T系 粒单系 巨核系 红系 3.双表型/双克隆型 T/B 2 2 0 0 0 T/M 0 2 2 0 0 B/M 2 0 2 0 0 4.未分化型 AUL 2 2 2 2 2 9Keylab of Medicine School of Su Zhou University B细胞系ALL的免疫分型 亚亚型CD19CD20HLA-DRCD10CyIgSmIgFAB分型 早前B-ALL+L1,L2 前B-ALL+/+L1 普通B-ALL+/ +L1,L2 成熟B-ALL+/ /+L3 10Keylab of Medicine School of Su Zhou University T细胞系ALL的免疫分型 亚型 CD7 CD2 TdT FAB分型 早前T-ALL + + L1,L2 T-ALL + + + L1,L2 11Keylab of Medicine School of Su Zhou University 免疫分型的价值 n确定ALL的细胞类型（B细胞或T细胞） 和ALL的分化阶段。 n鉴定AML的特征。 n对形态学上未分化的急性白血病有助 于鉴定细胞类型。 n诊断一些少见类型的白血病。如：M6 、M7、M0等。 12Keylab of Medicine School of Su Zhou University n诊断双表型/混合细胞型急性白血病。 n鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达（My+） 或AML伴有淋系抗原表达（Ly+）。 n鉴别急性白血病与其他造血系统和非造 血系统恶性肿瘤。 n根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某 核型异常相关的亚型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。 13Keylab of Medicine School of Su Zhou University 慢性白血病免疫分型 v慢性粒细胞性白血病主要用于急变期的 分型（同急性白血病免疫分型）。 v慢性淋巴细胞性白血病除了鉴别是T还是 B淋巴细胞型外，还用于与反应性淋巴细 胞增多症的鉴别，以及与部分淋巴瘤的 鉴别诊断。 v一些少见的白血病如：毛细胞白血病、 浆细胞白血病、恶性组织细胞性白血病 等的诊断与鉴别诊断。 14Keylab of Medicine School of Su Zhou University 2、再生障碍性贫血的研究 AA是一组由不同发病机制介导的骨髓造 血功能障碍综合征，其发病机制复杂，目 前尚未完全明了，但越来越多的临床和实 验证据表明，免疫介导的造血抑制AA最常 见的病理机制之一。而且，具有免疫表型 异常（如：CD4/CD8倒置，CD8+、活化T细 胞或TCR异常增高等）的患者，临床表 现相对严重，但免疫抑制治疗相对有较好 的疗效。 15Keylab of Medicine School of Su Zhou University 常用的淋巴细胞表面标志物 淋巴细胞亚群 T细胞： CD3+ 、TCR/ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc) B细胞： CD19+ NK细胞： CD3- CD16+ CD56+ 16Keylab of Medicine School of Su Zhou University 淋巴细胞亚群细分： T细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+ B细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+ 17Keylab of Medicine School of Su Zhou University 活化淋巴细胞亚群： 活化总T细胞： CD3+ /HLADR+ 静止总T细胞： CD3+ /HLADR- 活化CD4+细胞：CD4+ /HLADR+ 活化CD8+细胞：CD8+ /HLADR+ 活化诱导分子： CD69 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞 18Keylab of Medicine School of Su Zhou University 根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同 CD4+: Th1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL4+ Th0:CD4+IFNr+IL4+ CD8+: Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD8+IFNr+IL4+ 19Keylab of Medicine School of Su Zhou University Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和 活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。 其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自 身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病 和免疫病理损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化 和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功 能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合 症和嗜酸性粒细胞增多症。 Th1/Th2细胞平衡偏移多见于：感染症、自身免疫病 、过敏症、排斥反应、免疫缺陷、肿瘤恶化等。 检测Th1/Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展 的状况，为临床调整Th1/Th2细胞平衡偏提供正 确的治疗依据。 20Keylab of Medicine School of Su Zhou University 3、血栓与止血 血小板糖蛋白 血小板质膜糖蛋白 GPa ：CDw49b GPa： CD61 GPb ：CD42b GP： CD36 GPc ：CDw49f GP： CD42a GPa ：CD29 GPb： CD41 GPa：CD31 血小板颗粒膜糖蛋白 颗粒：CD62P (GMP140、PADGEM) 颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白 CD63 溶酶体相关膜糖蛋白-1 LAMP-1 溶酶体相关膜糖蛋白-2 LAMP-2 21Keylab of Medicine School of Su Zhou University 活化血小板检测 CD62P， CD63 GPb/a复合物(CD41/61) GP(CD36) PAC-1 Thrombospondin 血小板内钙离子 22Keylab of Medicine School of Su Zhou University 遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断 巨血小板综合症(BSS) GP Ib-(CD42a/CD42b)缺陷或缺乏 血小板无力症(CT) GP b/a(CD41/61)缺陷或缺乏 贮存池疾病 -SPD下降 23Keylab of Medicine School of Su Zhou University 4、CD34的绝对计数 随着近年来外周血造血干细胞移植病例 的日益增多，外周血造血干细胞的流式定量 越来越成为一个突出的话题。如何准确地定 量干细胞数量，什么是有效的质量控制成了 各大实验室的话题。1989年，欧洲人创建了 米兰方案，利用SS与CD34作双参数直方图， 计算CD34阳性细胞数；同年，北欧人改进了 米兰方案，加入了对照，称之米兰/北欧方 案。 24Keylab of Medicine School of Su Zhou University 1995年，血液病治疗及移植国际联合 会(the International Society of Hematotherapy and Graft Engineering ，ISHAGE)成立了干细胞绝对计数 (Enumeration)小组，致力于寻求一种简单 、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定 量外周血中的造血干细胞数量。这一方法 必须是对于临床实验室中不同的流式细胞 仪都有效，而且在不同的移植中心具有可 比性。这一方案即在96年问世的ISHAGE方 案，至今为止，其他各种方案改进均以此 方案为基础。 25Keylab of Medicine School of Su Zhou University 5、多药耐药（MDR）的研究 白血病治疗的失败再很大程度上是由于白血 病细胞对化疗药物产生了耐药。因此对白血病耐 药机制的研究具有重要的意义。但是耐药的形成 过程却很多。主要有几个方面：药物吸收减少、 细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复 能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑 制等。 26Keylab of Medicine School of Su Zhou University 常见的流式检测项目： v参与药物在细胞内外转运的蛋白： P-170、MRP、LRP、BCRP、MVP v参与细胞解毒的酶： ALK、GST、GSH、MS v抑制细胞凋亡的蛋白： bcl-2/bax、P53 v药物泵的功能检测： 罗丹明123（R123）或柔红霉素 27Keylab of Medicine School of Su Zhou University 6、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH) 阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH) 是由于造血干细胞发生体细胞突变而 引起的获得性溶血性贫血,典型病例有 发作夜间血红蛋白尿,可伴全血细胞减 少.其溶血是由于红细胞膜的获得性缺 陷,对激活补体异常敏感所致的一种慢 性血管内溶血。 28Keylab of Medicine School of Su Zhou University v随着流式细胞仪的逐渐推广，流式细 胞术检测CD55、CD59以能从病理上 提供直接的证据而得到广泛的应用。 正常人的红细胞、网织红细胞、粒细 胞、血小板上CD55、CD59表达完全 阳性，而PNH患者细胞则分为三型（ 依据CD55、CD59缺乏或减少的程度 ） 29Keylab of Medicine School of Su Zhou University 流式细胞术在PNH诊断中须注意的事项： 1、尽量同时检测红细胞和粒细胞的CD55与CD59的 表达情况。因为PNH克隆来源的红细胞在溶血后和 输血后，红细胞中PNH克隆细胞会减少或检测不到 ，而对粒细胞则影响很小。同时检测红细胞和粒细 胞CD55和CD59可以区分小细胞低色素性贫血和 PNH，小细胞低色素性贫血只有红细胞上的CD55 和CD59减少，粒细胞上CD55和CD59正常。 2、在检测红细胞的CD55与CD59时，可以用全血标 记，但必须稀释。而在检测粒细胞的CD55与CD59 的表达时，必须先溶血再标记。因为红细胞数远远 高于粒细胞，红细胞的存在会与粒细胞竞争对 CD55与CD59的结合。 30Keylab of Medicine School of