应用四环素调控系统研究tgf1定量表达课件

应用四环素表达系统上调内源性 TGF-1表达对HL-60细胞 增殖、分化及凋亡的影响 研究生：杨大柳 导师：陈元仲 前 言 TGF-1是迄今为止了解的功能最复 杂的细胞因子之一，目前已知的功能主要 有调节细胞生长和分化，诱导细胞凋亡， 影响细胞粘连和细胞迁移，调节胚胎发育 过程，促进细胞外基质的形成，促进创伤 愈合，参与对免疫抑制及对炎症反应的调 节等。近年来的研究表明TGF-及其受体 与肿瘤的发生、发展密切相关。 TGF-1是目前所知最强的血细胞增殖 抑制因子，在造血细胞生长、增殖、分化 及凋亡中起重要作用 。 本课题组前期研究发现，从早期造血干细胞、单个核细胞到终 末期细胞如分化成熟的粒细胞及血小板均表达TGF-1，提示内源性 TGF-1是促进血细胞的分化、调亡的内在动力，进一步研究发现采 用全反式维甲酸（ATRA）及AS2O3诱导HL60细胞分化、凋亡过 程中伴有内源性TGF-1 mRNA表达上调、bcl-2表达下调，将p53 基因导入HL-60、K562细胞，发现p53 基因在诱导 HL-60、K562 细胞凋亡的早期，内源性 TGF-1 mRNA 表达上调，且细胞分泌 TGF-1蛋白的水平有明显提高，为了证实上述假说，我们应用TGF -1反义siRNA ODNS抑制内源性HL-60细胞TGF-1表达，发现其 能阻断ATRA及AS2O3诱导细胞分化与凋亡，同时伴bcl-2表达恢复 。 我们前期研究还发现急性白血病患者血清中TGF-1 水平明显减低，经治疗获缓解后其水平恢复正常，复发 患者TGF-1水平又降低，急性白血病原代细胞和细胞株 培养上清TGF-1水平与正常细胞相比有明显下降。进一 步将外源性猪TGF-1基因转染HL-60细胞，也证实可以 抑制HL-60细胞增殖、诱导细胞凋亡，提示内源性TGF- 1表达缺陷可能是导致白血病细胞凋亡受阻、过度增殖 的原因。 以上研究不足： 1、外源性TGF-1因子 2、猪全长TGF-1基因 3、瞬时转染 四环素调控系统是目前应用最为普遍的人工表达调控系统之一， 该系统由三部分组成:转录调节子、四环素反应性启动子和四环素及 其衍生物。转录调节子由大肠杆菌Tn10转座子的抗四环素操纵子 的阻遏蛋白( tetR)和转录活化蛋白(TA)或抑制蛋白 (TS)两部分组成; 四环素反应性启动子包括可以和tetR结合的七个拷贝的操纵子序列 及其下游的TATA盒、转录起始点三部分，最常用的启动子来自人 巨细胞病毒即刻/早期启动子，四环素及其衍生物可以和TetR结合 ，应用于人和动物副作用较小，而且能够穿过胎盘屏障和血脑屏障 ，由于它的亲脂性，可以被动穿过真核细胞膜发挥作用。 一、含人全长TGF -1 cDNA真核表达载体pcDNA4- TGF-1的构建及 其双稳定转染HL-60细胞的筛选 二、TGF-1基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究 三、TGF-1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究 第一部份 含人全长TGF -1 cDNA真核表达载体 pcDNA4- TGF-1的构建及其双稳定转染 HL-60细胞的筛选 材 料 与 方 法 实验材料 1、pcDNA3- TGF -1真核表达载体由复旦大学张 农教授馈赠，来自pSP65- TGF -1(源于德国 Dr,Odenthal博士)。 2、其余实验材料分别购自： Invitrogen公司、 TaKaRa公司、 QIAGEN 公司、 Promega公司 等生物试剂公司。 细胞株及培养条件 HL-60细胞为急性粒细胞白血病细胞株， 为本研究所保藏，HL-60细胞培养于含10 FBS的RPMI1640培养液中，在37， 5CO2,饱和湿度条件下的CO2培养箱中 培养。 重组真核表达载体pcDNA4- TGF-1的构建 重组质粒的鉴定 1、阳性菌落的PCR 鉴定 2、重组质粒的酶切鉴定 3、重组质粒的测序 质粒转染及筛选实验方法 确定HL-60对Blasticidin及 Zeocin的敏感性 1、用含不同浓度的Blasticidin或Zeocin培养基 2、每天观察细胞，每三天用含不同浓度Blasticidin及 Zeocin培养液的更换培养液一次。 3、以四孔细胞全部死亡的Blasticidin及Zeocin最低稀释浓 度为筛选浓度。 细胞转染 1、 pcDNA6/TR质粒转染HL-60细胞并筛选 抗性细胞克隆TREx-HL-60。 2、pcDNA4TGF-1质粒转染TREx-HL-60 细胞并筛选抗性细胞克隆。 转染效率的测定 荧光表达的pIRES2-EGFP空载体转染后 24h，调整细胞浓度，加细胞悬液于细胞 计数板，荧光显微镜下观察发绿色荧光的 转染阳性细胞，计算转染效率。 转染效率=发绿色荧光的细胞数/细胞总数。 抗性细胞克隆的鉴定 1、增加抗生素浓度培养（达10倍筛选浓度 ） 2、RT-PCR检测TGF-1 mRNA表达 实验分为对照、低、中、高剂量4组（分别含Tet浓 度为 0ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,20ug/ml） 3、ELISA法检测细胞培养上清中TGF-1蛋 白水平 实验分为6组（A、B、C、D、E、F组）分别含Tet 0ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、20ug/ml， 100ug/ml。 结 果 PCR鉴定阳性菌落 酶切鉴定阳性菌落 重组质粒的DNA测序和同源性分析 抗生素筛选浓度 Blasticidin筛选浓度为2g/ml Zeocin筛选浓度为750ug/ml 瞬时转染效率 RT-PCR鉴定抗性细胞株 ELISA法检测抗性细胞株经Tet诱导后上清 TGF-1蛋白的变化 讨 论 转基因技术和基因疗法能被安全有效使用 的关键在于基因表达能否被实时、定量地控制 ，最近几年已有一系列基因表达人工控制系统 出现,其中最有效的方法是在转录水平上的控制 ，通过用特定药物或激素供给或移去目标基因 上游部分的有效“基因开关”,可以使外源基因的 转录在准确的时间、一定的水平或特定的组织 中准确地打开/ 关闭，这些成功的控制系统给出 了可以准确地控制生物体外源基因表达的实用 方法,并使基因治疗的广泛应用成为可能。 本研究使用的pcDNA4/TO是一种可利用四环素调控 的DNA载体，本实验通过酶切、提纯、质粒连接成功的 将人的TGF -1上导入pcDNA4/TO ， 通过PCR鉴定、 酶切鉴定出的阳性菌落，最后经过测序鉴定证实均已将 人的TGF -1上插入pcDNA4/TO质粒载体中，鉴定结果 显示连入方向有正向和反向。我们选定2号正向插入的阳 性菌落进行DNA大量纯化而获得了可调控的pcDNA4- TGF-1质粒，随后进入下一步的细胞转染。 细胞转染技术 物理介导（电穿孔法 ） 生物介导（病毒介导的转染技术 ） 化学介导（脂质体转染方法 ） 我们还应用RTPCR和ELISA检测法鉴定了抗性双 转染单克隆细胞，在不同浓度诱导剂培养基中检测了转 基因TGF1HL60细胞的TGF-1 mRNA和蛋白的表达， 检测结果表明了载体pcDNA6/TR和pcDNA4 TGF-1双 转染的TGF1HL60细胞在一定浓度诱导剂的作用下可 上调目的基因TGF-1表达，并且表达量与诱导剂Tet浓度 正相关，鉴定结果提示我们筛选得到的是所需的单克隆 细胞株。本实验的意义在于我们得到了能够通过诱导剂 自由地定量调控表达TGF-1的细胞株TGF1HL60 ， 为进一步研究TGF-1的对白血病的作用机制提供了更可 靠的手段。 第二部分 TGF-1基因修饰的HL-60细胞 生物学特性研究 材 料 与 方 法 实验材料 蛋白提取液购自PIERCE公司；MTT、 DEPC、ATRA购于Sigma 公司；流式细胞仪凋亡检测试剂盒（ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I）、TUNEL试剂盒（Dead End TM Colorimetric TUNEL System）为Promega公司产品；细胞周 期检测试剂盒购自北京天来公司；CD33、CD11b抗体购自 BECKMAN COULTER公司；兔抗人TGF1、-actin、Bax、C- myc、bcl-2单抗购自Ebioscience公司；辣根标记山羊抗兔IgG购自 北京中山生物技术公司；0.1%NBT- TPA丙酮溶液购自Fluka公司 ；余同第一部分。 分 组 实验分为五组： A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 20ug/mlTet HL-60细胞 C组：低剂量组 0.8ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 D组：中剂量组 4ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 E组：高剂量组 20ug/ml Tet ， TGF1-HL60细胞 细胞增殖实验 细胞生长曲线（MTT法） 集落形成抑制试验 细胞凋亡实验 1、细胞DNA片段化检测 2、TdT酶介导的原位缺口标记(TUNEL法) 3、Annexin-FITC/PI双标记流式细胞术检 测细胞凋亡 4、 DNA倍体分析及细胞周期分析 细胞分化实验 实验分为六组： A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 20ug/ml Tet, HL-60细胞 C组：阳性对照组 ATRA 1uM ，TGF1-HL60细胞 D组：低剂量组 0.8ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 E组：中剂量组 4ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 F组：高剂量组 20ug/ml Tet ， TGF1-HL60细胞 细胞分化实验 1、细胞形态学检查 2、NBT 还原试验（比色法） 3、流式细胞术检测细胞表面CD33、CD11b抗原 表达 RTPCR测定凋亡相关基因 mRNA表达 Western blot 测定凋亡 相关蛋白表达 TGF-1 C-myc Bcl-2 Bax 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗、二抗孵育 显色 结 果 细胞生长曲线 集落形成抑制试验 细胞凋亡 TUNEL检测结果 C组：5.9% D组：15.8% E组：21.7% Annexin-FITC/PI双标记流式细胞 术检测细胞凋亡结果 C组：12.6% D组：16.0% E组：20.7% DNA倍体分析及细胞周期分析 检测结果 细胞分化 NBT 还原反应实验 转染细胞表面CD33、CD11b抗原表达 凋亡相关基因的表达 凋亡相关蛋白表达 讨 论 TGF-1是最重要的造血负调控因子之一, TGF-1对白血病细胞有直接的抑制作用， 这种抑制作用与它引起的细胞凋亡有关。 我们成功利用Tet-on系统将外源性人全长 TGF - 1 cDNA 导入HL-60 细胞，并筛选得到能调控表达TGF - 1的单克隆细胞株TGF1HL60，本实验进一步研究了 不同浓度诱导剂Tet对双稳定转染细胞TGF1HL60生 长增殖、分化、凋亡的影响，实验发现经Tet诱导产生 的TGF - 1高表达可抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡 ，经诱导产生的TGF - 1还有促进诱导细胞分化作用， 增加HL-60表面CD11b的含量。CD33、CD11b抗原是髓系 细胞的特异分化抗原，随着细胞的分化成熟， CD33的 表达下降而CD11b的表达上升,说明诱导产生的TGF - 1 还有促进细胞分化作用，由于在单克隆细胞上进行的研 究，更有说服力。 为进一步探讨这种作用的机制，我们 利用半定量RT-PCR及Western Blot检测 了TGF - 1 、Bcl-2、c-myc、hTERT、 Bax、fas等基因和/或蛋白，观察上述基 因及蛋白表达水平的变化，结果观察到通 过Tet诱导，转染细胞随着TGF - 1 mRNA 水平表达增高， bcl-2、fas、c- myc 、hTERT mRNA 表达的下降，而 Bax表达量却增加 。 第三部分 TGF-1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种 移植瘤作用的研究 材 料 与 方 法 1. 药品与试剂 依托泊甙（VP16）购自上海华联制药有限公司产品； 余同第一部分。 2. 动物及细胞株 6-8周龄的BABL/C裸鼠，体重16-18克，雌性，由中国 医学科学院上海实验动物繁育中心提供，为无特殊致病 菌（SPF）动物，合格证号为SOXK（沪）2003-0003 。 实验分组及给药方案 实验分为六组：(腹腔注射） A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 10mg/kg Tet , HL-60细胞 C组：阳性对照组 VP-16 4mg/kg，TGF1-HL60细胞 D组：低剂量组 0.4mg/kg Tet， TGF1-HL60细胞 E组：中剂量组 2mg/kg Tet， TGF1-HL60细胞 F组：高剂量组 10mg/kg Tet ， TGF1-HL60细胞 检测指标 1、体重变化 2、肿瘤体积变化及瘤重 抑瘤率计算 抑瘤率（IR）（1实验组平均瘤重/对照组平 均瘤重）100% 3、血常规及肝肾功能 4、组织病理观察 5、透射电镜观察 结 果 肿瘤体积生长 透射电镜的观察结果 瘤块病理组织学检查结果 荷瘤裸鼠心、肺、肝、脾、 肾病理 学检查结果 讨 论 随着医学的发展与进步，急性白血病的治疗水平也 有了很大提高，人们不仅仅满足于病人的完全缓解，而 致力于最终使病人长期无病存活乃至痊愈的研究，目前 白血病的治疗方法有化疗、中西医结合治疗、骨髓移植 、生物调节剂治疗、基因治疗等方面。化疗和骨髓移植 作为治疗白血病的重要方法已被广泛应用,但化疗和骨髓 移植同时也带来很多并发症,并且复发率很高 ，近年来 ，白血病的靶向治疗，基因治疗、白血病细胞疫苗、细 胞因子越来越引起重视，自体或异体来源的肿瘤细胞灭 活后联合卡介苗、干扰素或粒-巨噬细胞集落刺激因子等 佐剂，可延长患者的生存期。 细胞因子网络的稳定是维持造血系统内环 境稳定的关键因素之一，但细胞因子网络失衡 在白血病的发病机制中的作用目前仍不明确。 目前的化疗使白血病患者的生存率得到明显的 改善，而细胞因子作为化疗的辅助手段使患者 的生存率得到进一步的提高。由于化疗对正常 细胞的毒性作用以及白血病细胞耐药性的增加 ， 目前认为细胞因子辅助应用于白血病的治疗 是较有前景的方法之一。 本实验结果显示：诱导剂诱导产生内源性TGF-1对 裸鼠异种移植瘤的生长具有明显抑制作用，它能延长移 植瘤的成瘤时间，将裸鼠成瘤时间延长一到二天，也能 抑制移植瘤的生长，抑瘤率分别达到20.7%（低剂量组 ）、30.9%（中剂量组）与58.0%（高剂量组），提示 这种作用与诱导剂的浓度成正比，从实验结果显示单纯 的诱导剂本身没有抑瘤作用，我们认为诱导剂Tet是通 过诱导转染细胞内源TGF-1高表达而产生抑瘤作用的。 在给药期间观察裸鼠一般状况，未发现诱导剂有明显毒 副作用，经检测裸鼠血常规及血肝肾功能，以及心、肺 、肝、脾、肾等重要脏器病理检查，亦未发现Tet对以 上重要脏器有明显的损害，说明在实验剂量下Tet毒副 作用不大，能用于机体研究。 结 论 1. 本研究成功的构建含hTGF-1的pcDNA4/TO 真 核表达载体，通过PCR鉴定、酶切鉴定并最终 经测序确认，命名为pcDNA4 TGF1。 2. 成功地建立了以重组可调控真核表达载体 pcDNA4- TGF1及pcDNA6/TR双转染的HL-60 单克隆细胞株，命名为TGF1HL60细胞 。 3. 以TGF1HL60细胞为研究对象，通过添加不同剂量诱导剂Tet上 调转染细胞TGF-1表达量，进一步证实了TGF