禽流感免疫胶体金快速检测技术研究课件

禽流感免疫胶体金快速检测技术研究 研究的背景和意义 lAI爆发时来势凶猛，新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧 业和人类健康，对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容。禽 流感的检测方法虽然已有较多报道，但多数方法需要特殊的仪器设备，且在 灵敏性、特异性等方面存在不同差异，多数方法只能在实验室中完成。因此 急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法。 l免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种 快速免疫学检测技术。近几年该技术已经引起兽医界的重视，猪瘟免疫抗体 、口蹄疫抗体、猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有 用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试验。 l禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测，该测试 条在国外已有生产，我国还未见有相关研究的报道。本试验将免疫胶体金诊 断技术用于AIV的检测，该方法的确立将为实现临床快速、准确诊断禽流感提 供有效检测方法。 研究内容 1.通过对抗AIV McAb、羊抗AIV多克隆抗体的制 备，获得高效价的单抗和多抗。 2.制备性能稳定、免疫学活性好的金标AIV McAb，并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显 色源，将抗AIV多克隆抗体结合于硝酸纤维素 膜上作为捕获抗体，制备AIV免疫胶体金层析 测试条，初步建立AIV免疫胶体金层析法。通 过与双抗体夹心ELISA比较、对AIV免疫胶体金 层析法作出评定。 BALB/c鼠 细胞融合，筛 选、制备、鉴 定、提纯单克 隆抗体 间接 ELISA法 建立AIV免疫胶体 层析法 禽流感抗原 免疫动物 比较 采小鼠脾脏 集小鼠血清 羊 对AIV免疫胶体金层 析法作出评定 制备金 标抗体 技术路线 制备羊抗 AIV多克 隆抗体 胶体金 颗粒的 制备 确定最适标 记量、标记 条件 结合垫上喷 涂金标抗体 购进羊 抗鼠IgG 处理结合垫 及样品垫 NC膜上喷涂 各种抗体 建立禽流感夹心 ELISA诊断方法 免疫胶体金测试条 的组装 试验一 抗AIV McAb的研制 lAIV抗原的纯化及鉴定 lBALB/c小鼠的免疫 l阳性McAb筛选方法的建立 l细胞融合及培养 lMcAb的大量制备及生物学特性鉴定 ： McAb的Ig亚型鉴定 ，McAb特异性鉴定试 验 ，McAb的提纯及效价测定 标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶 Sephadex G- 200柱层析，分次收集并测定各管蛋白含量，经 过0.01mol/L PBS（pH为7.4）洗脱，所得的洗脱 峰如图。 AIV的分离纯化 收集6178号管内样品，用国外标准禽流 感胶体金试纸条初步鉴定结果如图 。 AIV胶体金试纸条鉴定结果 AIV 10 SDSPAGE鉴定结果 1 2 3 1,泳道为提纯提纯前AIV抗原；2泳道为提纯后AIV抗原； 3泳道为蛋白质Marker 间接ELISA抗原与抗体的工作浓度的确定 Ab Ag(g/ml) 1:5001:10001:20001:40001:8000 空白 + + + + + 401.85 0.0841.68 0.0731.49 0.0691.31 .0781.14 0.0680.057 0.058 201.79 0.0791.61 0.0721.43 0.0681.28 0.0791.11 0.0720.059 0.062 101.67 0.0711.58 0.0671.34 0.0691.15 0.0821.04 0.0740.061 0.066 51.45 0.0641.26 0.0741.13 0.0700.97 0.0760.86 0.0870.061 0.058 2.51.14 0.0721.03. 0.0720.82 0.0740.69 0.0750.54 0.0710.058 0.063 1.250.98 0.0760.73 0.0790.51 0.0710.34 0.0690.21 0.0890.064 0.063 0.750.71 0.0730.52 0.0700.38 0.0750.21 0.071 0.106 0.069 0.062 0.061 0.350.57 0.0840.39 0.0810.23 0.0790.19 0.0750.08 0.0890.061 0.057 抗原工作浓度为10 g/ml，一抗的工作浓度为1:8000 融合前后细胞形态观查 SP2/0 3d 5d 6d 8d 细胞融合及筛选 选择其中OD450值较高的孔进行亚克隆，采用有限稀释法，经过反复筛选及二次 亚克隆获得两株能稳定分泌抗AIV抗体的杂交瘤细胞株，分别命名5A6，5G7。 板号融合孔数融合率 ELISA 阳性孔 数 ELISA阳性 率 16969/9699/69 24848/9677/48 36767/9688/67 46868/9699/68 56464/961212/64 总计316316/4804545/316 Total65.814.2% McAb的Ig亚型鉴定 试纸 条的G1，区各出现一条清晰的 条带，表明单抗的亚型属IgG1, 型 。 McAb的提纯 1 2 3 单抗提纯SDSPAGE电泳图 注：1,2泳道为提纯AIV McAb ； 3泳道为蛋白质Marker 。 McAb交叉间接ELISA试验结果 杂交瘤细胞株小鼠腹水稀释度（效价） 抗原1:4001:8001:16001:32001:64001:128001:25600阴性阳性空白 NDV MDV IBV H9 AIV H5 AIV 标准AIV 0.107 0.109 0.115 1.983 1.985 1.989 0.111 0.107 0.116 1.788 1.786 1.772 0.106 0.109 0.107 1.475 1.455 1.472 0.102 0.115 0.124 1.280 1.279 1.258 0.103 0.110 0.121 0.985 0.980 0.979 0.109 0.111 0.113 0.951 0.942 0.946 0.106 0.117 0.126 0.838 0.844 0.847 0.088 0.086 0.079 0.114 0.109 0.107 0.109 0.108 0.080 1.79 1.78 1.798 0.087 0.082 0.083 0.079 0.081 0.085 提纯腹水效价间接ELISA测定结果 效价 腹水 1:10001:20001:40001:80001:160001:320001:640001:128000阴性空白 提纯前 提纯后 1.454 1.087 1.269 0.968 1.083 0.759 0.952 0.612 0.790 0.549 0.633 0.429 0.524 0.314 0.447 0.256 0.148 0.132 0. 0 小结 （1）本试验用提纯的禽流感标准抗原通过间接ELISA法筛 选最终获得了两株抗禽流感McAb细胞株，将其命名为 5A6 ， 5G7。特异性试验证明所获得的两株杂交瘤细胞 分泌的抗体能特异性针对禽流感抗原的共同表位。 （2）对单抗采用乳胶凝集试剂条进行亚型鉴定，结果表明 单抗的亚型属IgG1, 型。采用辛酸-硫酸铵提取IgG1型 的单抗的方法，达到了较满意的结果。提纯后的单抗特 异性好，效价高，可直接用于胶体金标记，将在AIV的 诊断和检测发挥重要作用。 试验二 禽流感免疫胶体金层析法的建立 l羊抗AIV抗体的制备 l制备胶体金颗粒、金标抗体,免疫胶体 金测试条的组装 l免疫胶体金层析法各种最佳条件的选 择 羊抗AIV抗体效价测定 琼 扩 试 验 效 价 1:8 以 上 不同胶体金颗粒标记抗体效果 如表所示，40 nm的胶体金很不稳定，制备起来 很困难，容易产生沉淀，20 nm的胶体金灵敏度 较差；30 nm的胶体金稳定性、灵敏度均较好。 质量 20 nm 30 nm 40 nm 稳定性 灵敏度 半年内未出 现沉淀 15ng/ml 半年内未出 现沉淀 5ng/ml 2月后出现 沉淀 5ngml 抗体最适稳定量 空白 5 10 15 20 25 30 35 40 45 目测法结果如图所示，使胶体金的红色不变的最低抗 体稳定量是15 g/ml。在此基础上再加上20%即为稳定所 需抗体的实际用量，18 g/ml。 加入抗体后反应时间的确定 金颗粒中加入最佳量的抗体后不同反应时间的标记结果表明， 在70 min以上的胶体金溶液存放半年以上无沉淀产生。而45 min和60 min标记的金颗粒分别在3个月、5个月出现沉淀。因 而选择标记时间为70 min。 金标抗体的稳定剂的选择 BSA稳定的标记胶体金，放在4达1年以上半仍然保持良好性 能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4，4个月左右就有分层 现象，且灵敏度亦下降。因此，选择BSA作稳定剂。 金标抗体的保存液的选择 2 mM pH8.2硼酸缓冲液中以含5 mM NaCl、1%BSA作保存 液的胶体金,稳定性良好，半年内未出现沉淀；含5 mM NaCl、 10%蔗糖保存的胶体金半年内出现沉淀；含5mM NaCl、20% 蔗糖保存的胶体金，2月后出现沉淀。 结合垫处理液的选择 编号为的结合垫处理液浸泡过的玻璃纤维膜释放金标抗体的效果最好。 试剂 Na2B4O710H2O(mM） 70 708080 90 90 PVA (%) 0.10.20.20.10.20.1 Tween-20 (%) 0.20.20.10.10.10.1 BSA (%) 0.30.30.30.30.30.1 样品垫处理液的选择 编号为的液体处理的样品垫加样后，样品垫上的 流速快慢适中，符合要求，约10min内样品从测试条加 样端流到吸水纸端，且可在一定程度上控制非特异性反 应。 试剂 Na2B4O710H2O(g) 1.421.42 1.422.02.02.0 PVP-10 (g) 1.02.02.02.02.01.0 Triton-100(ml) 332322 BSA (g) 0.50.50.60.60.60.5 金标抗体、羊抗AIV IgG 、羊抗鼠IgG喷涂量的确定 试验组金标抗体喷涂量羊抗鼠IgG喷涂量羊抗AIV IgG喷涂量 (OD520=0.62)（8.0 mg/ml）（5.0 mg/ml） 11.50.50.5 21.50.750.75 31.51.01.0 42.50.51.0 52.00.750.5 62.00.50.75 72.01.00.75 82.50.750.5 92.51.01.0 7号效果最好，当稀释100后OD5200.62的金标抗体喷量为 2.0 l/cm，羊抗AIV IgG(5.0mg/ml)喷量0.75 l/cm，羊抗鼠IgG (8mg/ml)喷量为1.0l/cm时检测线、质控线最为清晰。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 阴性 测试方法与评判 取待检样品50 ul，滴于测试条的加样区； 待测样品按如图所示的方向，通过层析作用 ，从加样区经过检测线、质控线，最后到达 吸附区。反应经过10-15 min即可判定结果 。 加 样 区吸 附 区 反 应 区样品层析方向 质控线 检测线 AIV检测的评判标准 阳性 阴性 试纸条上出现两条红色为AIV阳性，若只有 对照线为红色则判为阴性。两条线均无显色 为测试条失效 稳定性试验 1d 3d 5d 7d 8d 37放置 1d、3d、5d、7d后的检测结果无明显差别，37放置8d 天后检测线不清晰；4放置1、2、3、4、5、6个月后的检测结果 无明显差别，4放置7个月检测线不清晰。 小结 l 成功地制备了30nm的胶体金颗粒，并制得了稳 定的金标McAb。 l初步建立了免疫层析装置中各系统的稳定反应体 系。 l利用抗AIV单抗及羊抗禽流感多抗初步建立了用 于检测AIV的免疫胶体金层析检测法，该方法具 有一定的灵敏度，操作简便，反应快速、特异性 强等特点。 试验试验 三 AIV免疫胶体金层析法与夹心ELISA法的比较 l建双抗体夹心ELISA方法 lAIV免疫胶体金层析法与双抗夹心 ELISA法的比较 灵敏度试验 、 特异性试验、准确度试验、重复性试 验 夹心ELISA法的程序表 步骤 内容 加入试剂 加入量 (l) 作用时间及温度 1包被一抗 McAb(Ab1) 100 37，2 h,再经4过 夜 2封闭 5% 脱脂乳 300 37， 2 h 3加入待检样品 阳性/阴性抗原 100 37，2 h 4加入二抗 羊抗AIV IgG(Ab2) 100 37，1 h 5加入酶标抗体 兔抗羊酶标抗体 (Ab3) 100 37，1 h 6显色 加入底物溶液 100 37，10-15 min 7加终止液 2 mol/L硫酸 5037或室温 5 min 8酶标仪测OD450值 Ab1、Ab2最佳工作浓度的选择的确定 用已知AIV标准抗原和阴性抗原进行了方 阵滴定（3次重复），结果分析表明，选择 Ab1浓度为1.25 g/ml、Ab2稀释度为1:32000 为最佳工作浓度。 灵敏度试验 以不同浓度AIV 标准抗原，做灵敏度试验，以OD450值为纵坐标， 抗原浓度为横坐，制备标准曲线如图，线性检测范围在7.5ng/ml- 500ng/ml，其线性良好，最低检测下限为3.75ng/ml。 对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测，重复检测16次，浓度在7.5ng/ml- 500ng/ml的结果为阳性。在7.5ng/ml与3.75ng/ml之间设7ng/ml、6.5ng/ml、 6.0ng/ml、5.5ng/ml、 5ng/ml、 4.5ng/ml、4.0ng/ml几个浓度度，再次进行 检测，当抗原浓度为5ug/ml时检测线反应结果较明现，抗原浓度为4.5ng/ml时反 应结果不明显。初步判定AIV免疫胶体金层层析法检检测的灵敏度为5ng/ml。 7 6.5 6.0 5.5 5 4.5 4.0 3.75 阴性 AIV免疫胶体金层析法灵敏度测定结果 特异性试验试验 夹心ELISA法、AIV免疫胶体金层析法检测NDV、IBV、IBDV、MDV 和禽流感标准抗原，用PBST液作空白对照。结果如下，双抗体夹 心ELISA方法与AIV免疫胶体金层析法，特异性强，与其他禽病呈 阴性反应。 待检样品AIVNDVIBV IBDVMDV空白 平均OD450值 1.376 0.078 0.073 0.0740.0790.062 AIV NDV MDV IBV MDV 空白 准确度试验 对标准曲线抗原高，中，低三个浓度的平均OD值检测，结果表明平 均回收率为97.63，说明所建立的双夹心ELISA法具有较高的准确 度，在作为对照试验时可信度较高，保证了在进行检测时其他指标的 可靠性。 抗原浓度 OD值1 OD值2 质控浓度回收率（%） 平均回收率 （%） 250 ng/ml 1.014 0.997 231.65 92.66 97.63 30 ng/ml0.539 0.521 28.93 96.44 7.5 ng/ml 0.230 0.238 7.79 103.8 注：OD值1为相应标准抗原浓度对应的值 OD值2为在相应抗原浓度下实际检测所得值 精确度试验试验 对不同浓度标准AIV抗原在不同批次的检测结果如上，用双夹心 ELISA法检测平均OD450值， 批内平均变异系数为4.99；批间平均 变异系数为5.92；AIV免疫胶体金层析法的阳性检出率，批内平均 变异系数为3.83；批间平均变异系数为4.89。表明这两种方法重 复性好，符合率高，说明二者具有较高的重复性，其性能稳定。 抗原浓度 （ng/ml ） 双夹心ELISA试纸条法 批内(5次)批间(5)次批内(5) 次批间(5)次 平均OD值CV%平均OD值CV%阳性率(%)CV%阳性率 CV% 2500.9980.031 3.10.99