深部真菌感染现状检测技术和药敏分析课件

侵袭性深部真菌病的实验室诊断侵袭性深部真菌病的实验室诊断 倪语星 上海交通大学医学院 附属瑞金医院 临床微生物科 1 侵袭性真菌病的致病菌侵袭性真菌病的致病菌 条件致病菌 致病性双相真菌 l念珠菌 组织胞浆菌 l曲霉 球孢子菌 l隐球菌 芽生菌 l接合菌 马内菲青霉 l镰刀菌 孢子丝菌 l暗色真菌 l酵母菌 l毛孢子菌 l枝顶孢霉 2 侵袭性真菌病(IFD)主要包括： l念珠菌病 l隐球菌病 l侵袭性曲霉病 3 高危人群高危人群+ +高危因素高危因素=IFD=IFD 4 IFDIFD的高危人群和高危因素的高危人群和高危因素 l广谱抗生素应用 l入住ICU l血液系统肿瘤病人（粒缺、骨髓移植 ） l器官移植 lHIV感染 l应用皮质激素 l糖尿病 l静脉插管 5 6 尸体解剖中侵袭性真菌感染的发生率尸体解剖中侵袭性真菌感染的发生率 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 0 2 4 6 8 Aspergillus spp. Candida spp. All other Prevalence at Autopsy % Prevalence of invasive aspergillosis at necropsy at JW Geothe University Hospital,Frankfurt,Germany(Lancet ,2000;335:2076) 7 54.84% 12.9% 3.23% 9.68% 19.35% 国内西南医院尸解资料，(1971-2000)，郝飞教授提供 AspergillusAspergillus Cryptococcus Mucor Candida All others 8 侵袭性真菌病的流行病学特点 l危险因素不断增多，发生率逐年增高趋势，确 切资料有待收集整理 l白念珠菌仍然是最常见临床分离致病菌 l非白念珠菌增加（带来的问题） l曲霉已成为重要的致死真菌 9 真菌感染的实验诊断方法及问题真菌感染的实验诊断方法及问题 l形态学检查：经验？阳性率？ l培养+鉴定：时间长，敏感性？ l血清学检查：敏感性？特异性？ l分子生物学检查：标准化？ 10 真菌抗原、细胞壁成分检测真菌抗原、细胞壁成分检测 GM试验：血浆、血清、BAL、 胸水、CSF，用于曲霉检测； G试验: 用于曲霉、念珠菌检测 ，对隐球菌、接合菌无意义； 乳胶凝集试验: 检测隐球菌； 11 新生隐球菌乳胶凝集试验新生隐球菌乳胶凝集试验 12 血清血清GMGM作为诊断的早期标志物作为诊断的早期标志物 Marr and Leisenring Clin Infect Dis 2005; 41:S381 13 在在BALBAL中检测中检测GMGM作为早期诊断标志作为早期诊断标志 Musher et al. J Clin Microbiol 2004: 42(12): 5517-22 敏感性 (%)特异性 (%)阳性预测 (%) 阴性预测 (%) 血清47937382 BAL8510010088 Becker et al. Br J Haematol 2003; 121: 448 14 关于关于GMGM试验与试验与GG试验试验 u可作为推定诊断的标准; uGM: 检测半乳甘露聚糖，对曲霉感染诊断特 异性强，假阳性反应可以在青霉菌属中出现； 部分含青霉烷砜衍生物的抗菌药物可以诱发阳 性反应； uG试验: 检测(1,3)-D-葡聚糖，在很多真菌中 都可以出现阳性反应，但在隐球菌、接合菌、 毛霉、根霉呈阴性反应； 15 Prospective utility of (1-3)-B-D-Glucan (BG), galactomannan (GM) and anti-Candida albicans germ tube antibodies (CAGT) for the diagnosis of invasive fungal disease (IFD) in haemato-oncology adult patients A. Alhambra1, M.S. Cutara2, J.M. Moreno1, A. Del Palcio Perez-Medel1, I. Moragues3, J. Pontn3, A. Del Palacio1 1Hospital Universitario Doce de Octubre, MADRID, Spain 2Hospital Universitario Severo Ochoa, LEGANES, Spain 3Universidad del Pais Vasco, BILBAO, Spain 16 Invasive Candidiasis S SP PPV NPV CAGT (%) 57 93 44 96 BG (%) 77 86 39 97 Invasive Aspergillosis S SP PPV NPV GM (%) 92 94 73 98 BG (%) 57 84 42 91 17 CONCLUSIONS The incidence of IFD correlated directly and significantly (x2 p=0.0005) with risk stratification group: highest proportion in the high-risk group. Since all the biomarkers have inherent limitations, a better diagnosis yield is achieved combining the biomarkers. All three biomarkers share high negative predictive value and can exclude reasonably IFD in haematology adult patients treated with wide spectrum antifungals. 18 Evaluation of two serologic test for diagnosis invasive Aspergillosis C. Castro, A. Romero, A. Aller, T. Gonzalez, A. Gonzlez, E. Martn-Mazuelos H. U. Valme, SEVILLA, Spain 19 A total of 236 sera from 51 patients in risk of IA were tested for GM using Platelia Aspergillus kit (Bio Rad, France) which 36 sera (10 patients) were tested for BG also using Fungitell kit (Associates of Cape Cod., USA). Patients were attended at the University Hospital of Valme from Seville from January of 2008 to December 2008. Patients with GM index 0.5 in two consecutive samples have been marked as GM positive and samples with results 80pg/ml were marked as BG positive. All GM positive patients were classified according to EORTC/MSG criteria (2008) for probability of IA. 20 GM testGM test lFrom 51 patient studied, 16 of them showed at least one positive specimen (33 sera). lOnly 6 patients showed two consecutive positive results (0.5 GM test) and they show clinical signs or microbiological criteria for AI proven (3 patients) and probable (3 patients). 21 BG assayBG assay lThe BG assay were used in parallel with GM in 36 sera which 26 showed positive result from 9 patients, (3 with AI proven and 6 AI probable). l3 patients showed positive results before for BG test ( 3,5 days) and 6 patients presented simultaneously both antigens. Never the GM test was the first serological test to show a positive result. lG试验阳性的9名患者中，G试验单独阳性的有 3个病人，两种抗原同时阳性有6个病人，未出 现单独GM试验阳性的情况。 22 Conclusion Calculating significant sensitivity for both detection methods was not feasible due to a low number of proven/probable AI. BG detection showed positive results before GM test and present the great advantage to be a “panfungal”antigen. BG detection should be used with other techniques for detection of invasive Aspergillosis infections. 23 真菌细胞壁结构示意图真菌细胞壁结构示意图 24 深部真菌感染患者血浆深部真菌感染患者血浆 1-3-D1-3-D葡聚糖检测葡聚糖检测 病例选择 深部真菌感染患者35例，年 龄 1288岁，来自我院2004年1月到5月住院患 者，均经培养证实存在深部真菌感染，感染 部位包括呼吸道、泌尿道、血液及静脉插管 引起的系统性感染。正常健康对照组30人， 来自我院健康查体者。 第四军医大学 25 检测结果检测结果 l正常对照组血浆1-3-D葡聚糖含量最高 为7.29 pg/ml ，最低为0.45 pg/ml，平均值 为2.832.57pg/ml； l深部真菌感染组血浆1-3-D葡聚糖含量 最高为168.9 pg/ml，最低为14.93pg/ml， 平均值为54.0636.13 pg/ml。 l经SPSS统计软件T-检验分析，对照组与深 部真菌感染组1-3-D葡聚糖平均值差异 非常显著（t=7.741,P0.001）。 26 讨论讨论 l入选的深部真菌感染患者均经细菌培养证实为 念珠菌感染，包括白色念珠菌23株、热带念珠 菌8株、季也蒙念珠菌1株、克柔念珠菌1株和 光滑球拟假丝酵母菌2株，无隐球菌感染。 l如以10 pg/ml为cutoff值，则阳性率为100%; 以 20 pg/ml为cutoff值，则阳性率为91.4。 l葡聚糖检测可在拟诊早期为临床医生提供机体 是否感染真菌的可靠信息，因此葡聚糖含量检 测不失为一种实用的真菌感染早期诊断方法。 27 注意注意 l使用青霉素类 l加酶抑制剂 l香菇多糖等 会引起假阳性！ 28 PCR PCRPCR技术用于诊断技术用于诊断 种特异种特异- -PCRPCR 非特异非特异 PCRPCR 杂交杂交 Standart Standart “ “singlesingle“ “ “ “nestednested“ “ PCR-EIAPCR-EIA “ “Real-timeReal-time“ “ 标本标本 全血全血 血浆血浆 血清血清 BALBAL 最低检测范围最低检测范围 4-10 cfu/ml4-10 cfu/ml 25-100 fg DNA25-100 fg DNA 原位杂交原位杂交 目的基因目的基因 多拷贝基因多拷贝基因 29 122 patients 323 samples 33 proven cases 122 patients 323 samples 33 proven cases Time Axis of Methods for Detection of Time Axis of Methods for Detection of Pulmonary AspergillosisPulmonary Aspergillosis CT positive CT positive 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 chest X-ray antigen -glucan-glucan culture cu