联合荧光定量pcr诊断结核性淋巴结炎课件

FNACFNAC联合荧光定量联合荧光定量PCRPCR 诊断结核性淋巴结炎诊断结核性淋巴结炎 安徽合肥市第一人民医院检验科血液肿瘤细胞室安徽合肥市第一人民医院检验科血液肿瘤细胞室 余小琴余小琴 主要内容 l世界结核病的流行趋势 l结核病病原学 l结核病发生学 l结核病免疫学 l结核病病理学 l结核性淋巴结炎的诊断标准 lFNAC联合荧光定量PCR在诊断淋巴结结核中 的作用 世界结核病的流行趋势 l全球结核病流行趋势 l我国结核病疫情现状 全球结核病流行趋势 l20亿人感染结核菌 l2000万活动肺结核患者 l每年新发8001000万例 l每年300万人死于结核病，多于艾滋、疟 疾、热带病死亡人数的总和。 l发达国家在持续30年疫情下降后，80年 代中后期又出现上升趋势 l90%的病例在发展中国家 全球结核病危机 l1、今后10年将有3000万人死于结核病，是单 一病原体所致疾病的最大死因。 l2、多数国家没有采取防治对策，忽视结核病 问题。 l3、贫穷、人口增多、人口流动频繁、耐多药 结核病及爱滋病的流行加重结核病的蔓延。 l4、结核病发病率在发展中国家高居不下，在 发达国家重新回升。 我国结核病疫情现状 l高患病率：患者数居世界第二，仅次于 印度，367/10万，约450万活动性肺结核 l高耐药率：初始耐药为18.6%，继发耐药 为46.5% l高死亡率：每年约13万人死于结核，是 其他传染病和寄生虫病死亡总和的2倍 我国结核病疫情现状 l高感染率：5.5亿人受结核菌感染 l农村疫情高于城市：比城市高1倍 l青壮年结核病患病率和死亡比例高：占 患者数为53%，占结核病总死亡的48% lHIV和结核菌的双重感染： 结核病病原学 l分类 l形态结构特征 l生长特性 l抵抗力 分 类 l属于分枝杆菌属，结核分枝杆菌群，引 起人结核病的分枝杆菌主要包括人结核 分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌 。以人结核分枝杆菌感染最常见。 形态结构特征 l为细长略带弯曲的杆菌，有时可见分枝 状，由于细胞壁富含脂质而呈抗酸染色 阳性。 生 长 特 性 l结核分枝杆菌为专性需氧菌，营养要求 高、必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘 油及某些无机盐的特殊培养基上才能生 长良好且生长缓慢、在固体培养基上2 5周才出现肉眼可见的菌落。 抵 抗 力 l结核分枝杆菌因细胞壁含大量脂类，其 对理化因素抵抗力很强。在干燥的痰内 可存活68个月，含有结核分枝杆菌痰 液的尘埃经810天仍有传染性。 l对湿热敏感，60度30分钟可将其杀死， 在75%乙醇中数分钟即被杀死。 石台县仙寓山 石台县秋浦河 结核病免疫学 l结核病是一个T细胞介导的保护性免 疫反应和病原性免疫反应调控紊乱 的免疫性疾病。以灭菌为核心的保 护性免疫反应和以组织坏死为特征 的病原性免疫反应构成了结核病临 床免疫学的本质。 保护性免疫反应 l吞噬细胞吞噬入侵的结核菌,再进行细菌 抗原加工后提呈给T淋巴细胞，引起T细 胞活化，分泌细胞因子，启动巨噬细胞 活化，活化的巨噬细胞出现上皮样细胞 形态改变，抗菌活性增加，杀灭细胞内 的细菌完成保护性免疫反应。 保护性免疫反应中参与的免疫细胞 lCD4+溶细胞T细胞：可协同CD8+细胞毒 T细胞裂解菌过载的巨噬细胞，供新的巨 噬细胞再吞噬，也是CD4+T细胞的一种 监测功能。 lCD8+细胞毒T细胞：是抗病毒感染的主 要保护机制，补充抗结核感染中CD4+T 细胞的保护作用。 病原性免疫反应（变态反应） l属于IV型即迟发型变态反应：引起IV型 变态反应的抗原主要有胞内寄生菌、病 毒、寄生虫和化学物质。这些抗原经 APC摄取、处理后提呈给T细胞，使之活 化为效应T细胞，释放多种细胞因子，促 使巨噬细胞和淋巴细胞在抗原存在部位 聚集，对靶细胞和周围组织细胞产生细 胞毒作用，引起组织损伤。 病原性免疫反应 l结核杆菌诱导的迟发型变态反应是结核病免疫 病原学的主要基础。 l在结核感染后期，肉芽肿中活化的吞噬细胞不 能清除感染，高细菌负载时，效应细胞因子可 诱导过载菌吞噬细胞和邻近细胞溶解坏死，形 成干酪核。当菌量大、毒力强、机体抵抗力差 时，过载菌吞噬细胞和邻近细胞对TNF-a敏感 性提高，干酪液化，结核杆菌即获得在胞外快 速增殖的机会，菌负荷进一步增加，病情恶化 。 保护性免疫反应和病原性免 疫反应的关系 l结核病的保护性免疫反应和病原性免疫反应是 分离的两个不同的；或有部分叠加效应的免疫 反应。 l保护性免疫反应：是Th1细胞介导IFN- l为效应因子以活化的吞噬细胞抗菌活性为表型 的反应。 l病原性免疫反应：TDTH细胞介导TNF- l为效应因子以菌过载巨噬细胞和邻近细胞的损 伤为表型的反应。 结核杆菌感染后的可能结果 1 1 细胞免疫应答能力正常，清除胞内结核杆菌：细胞免疫应答能力正常，清除胞内结核杆菌： 不发病（约占不发病（约占90%90%）；）； 2 2 细胞免疫应答能力低下，不能清除胞内结核杆菌：细胞免疫应答能力低下，不能清除胞内结核杆菌： 发病（约占发病（约占5%5%） ； 3 3 细胞免疫应答能力一般，胞内残留结核杆菌：细胞免疫应答能力一般，胞内残留结核杆菌： 潜伏感染（约占潜伏感染（约占5%5%） 。 泾县桃花潭 绩溪嶂山大峡谷 淋巴结结核 l定义 l发病机制 l诊断标准 l基本病理变化 l细胞学表现 l细胞学分型 定 义 l包括体表和深部淋巴结核。为肺外结核 的好发部位，以颈部淋巴结核最多，其 次为腋下。深部淋巴结核包括胸腔、腹 腔和盆腔。 颈部淋巴结结核发病机制 l1、头颈部器官结核菌沿淋巴管达颈部淋 巴结，多造成颈上淋巴结核。胸腔内的 结核向上蔓延，多累及锁骨上和颈深淋 巴结。 l2、全身结核通过血行播散至颈部引起颈 淋巴结核。 l3、既往的淋巴结核病变再燃复发。 结核性淋巴结炎的诊断 l计分法诊断： l淋巴结成堆、出现窦道、胸片示活动性 肺结核各为2分，年龄小于30岁、多于3 个淋巴结、多发、PPD10mm各为1分，总 计10分。若大于5分考虑为结核 基本病理变化 l分为4个阶段 l1、淋巴组织增生，结节或肉芽肿形成。 l2、淋巴结内干酪样坏死液化。 l3、淋巴结包膜破坏，互相融合合并淋巴 结周围炎。 l4、干酪样物质穿破至周围软组织形成冷 脓肿或窦道 淋巴结结核的细胞学表现 l主要有上皮样细胞、多核巨细胞、坏死 。不同的病理时期有不同的细胞学表现 。 淋巴结结核的细胞学分型 l1型：有上皮样肉芽肿，无坏死、小巢和 散在上皮样细胞，有反应性淋巴细胞， 但Langhans巨细胞少见 ； l2型：上皮样肉芽肿伴有坏死，与1型相 比涂片背景有不同数量淡染的无定形物 质； l3型：大量干酪样坏死无上皮样肉芽肿。 大别山 细针吸取细胞学联合荧光定量PCR 在诊断淋巴结结核中的作用 l背景 l病例的收集 lFNAC lFQ-PCR l抗酸染色 l结果 l结论 背 景 l临床遇到的问题如肉芽肿性炎的鉴别、其他诊 断淋巴结结核方法烦琐、结核菌培养耗时长等 。 l考虑联合PCR检测TB-DNA可以快速诊断，随 着病例数的积累发现不同细胞学表现TB-DNA 的阳性率和拷贝数有所差别。同时与目前常用 的抗酸染色进行比较，突出了PCR灵敏的优势 。 l增加非结核对照病例以证明PCR检测TB-DNA 的特异性，最终完成了这篇论文，发表在中 华结核和呼吸杂志2009年第一期 病例的收集 l收集2004年6月至2008年6月资料完整的 72例病人，体表淋巴结肿大，FNAC表现 为肉芽肿改变或与结核性病变相关 的病 例。 l多与临床沟通，保留病人联系电话，病 例资料及时整理。 病例的收集 l对照组病例共26例：包括淋巴结反应性 增生4例、转移癌15例、乳腺癌5例、甲 状腺乳头状癌1例、慢性粒细胞白血病急 变淋巴结浸润1例 。 FNAC l5ml 一次性注射器穿刺取材，1张做 瑞氏染色，1张做抗酸染色，其余立 即湿固定做H-E染色。用剩余的材料 或重复取材用无菌生理盐水洗入离 心管中用于PCR的检测。 PCR l 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）又称无细胞分子 克隆或特异性序列体外引物定向酶促扩 增技术。由美国PE公司遗传 部的dr. mullis发明，由于PCR技术在理论和应 用上的跨时代意义，因此mullis获得了 1993年化学诺贝 尔奖。 荧光定量PCR（FQ-PCR） l反应体系 l反应步骤 l l 基本原理基本原理 定量PCR反应体系 两条引物，非标记 一条探针，荧光标记 DNA模板 其他PCR成分(Mix) 耐热DNA聚合酶 四种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP s）, 缓冲液 H2O PCR反应步骤 l1、变性：加热至94度使目标DNA双螺旋 的氢键断裂，形成单链DNA作为模板。 l2、退火：将反应体系冷却至特定温度， 使引物与DNA模板互补区结合。 l3、延伸：温度升至72度并维持一端时间 ，在耐热DNA聚合酶的作用下合成新链 。 l以上三个步骤作为一个循环重复进行。 荧光定量荧光定量PCRPCR的基本原理的基本原理 扩增 5 3 5 5 3 5 正向引物 反向引物 TaqMan 探针 RQ 报告荧光 淬灭基团 报告荧光 淬灭基团 置换 5 3 5 5 3 5 R Q 正向引物 TaqMan 探针 反向引物 切割 5 3 5 5 3 5 Q R 正向引物 反向引物 扩增完成 5 3 5 5 3 5 RQ 正向引物 反向引物 PCR标准品扩增曲线 PCR样品扩增曲线 卫生部临床检验中心颁发的认 证证书 PCR实验室试剂间 PCR实验室样本间 PCR实验室扩增间 抗 酸 染 色 lWHO推荐发展中国家在结核病控制中采 用。 l优点：快速、简便、技术简单 l缺点：灵敏度低、无种特异性。抗酸性 是分枝杆菌属的共同特点。 抗 酸 染 色 l解释抗酸染色结果的注意事项： l目前关于抗酸菌等同于结核杆菌作为结 核病诊断依据的概念，是将这一非特异 指标依据临床经验和综合诊断基础上建 立的一种联想，并非实验室实际依据， 随着HIV病人的增加和非结核分枝杆菌的 流行，抗酸染色的特异性会下降，对抗 酸染色的结果应有全面的认识。 抗酸染色 结 果 lFNAC标本抗酸染色结果 lFNAC标本TB-DNA检测结果 lFNAC细胞学类型与TB-DNA检测结 果之间的关系 lTB-DNA拷贝数和抗酸染色结果的关 系 FNAC标本抗酸染色结果 l72例标本中64例进行了抗酸染色 ，其中14例阳性（22%） FNAC标本TB-DNA检测结果 l72例穿刺物进行FQ-PCR检测TB-DNA ，其中阳性46例，阳性率63.9% 。 l26例对照病例TB-DNA均为阴性。 FNAC细胞学类型与TB-DNA 检测结果之间的关系 l72例细胞学表现分型及TB-DNA结果为 ： l1型:7例TB-DNA的阳性率0% l2型:34例TB-DNA的阳性率61.2% l3型:31例TB-DNA的阳性率80.6% TB-DNA拷贝数和抗酸染色结果的关系 l抗酸染色阳性： 14