泛发性脓疱型银屑病与课件

泛发性脓疱型银屑病与HLA-DQB1 等位基因的相关性研究 研究生研究生 付洪付洪 军军 导导 师师 张福仁张福仁 前 言 q 定义与分型 v在最近新版的Rook教科书中，泛发性脓 疱型银屑病(GPP)被定义为银屑病的一种 不寻常变型，并以急性、亚急性、偶而 慢性的损害上发生无菌性脓疱为中心特 征。 q 依据临床表现把GPP分为5个亚型。即 ： v (1)急性泛发型(Von Zumbusch型) v (2)妊娠期GPP(IP) v (3)儿童型GPP v (4)环型GPP v (5)局限型GPP(不包括手足) q对这种分类中的IP仍有争议: 不支持观点：病史、诱因、某些化验室 检查、处理等不同。 支持观点：病理表现相似、妊娠可诱发 GPP、都具有HLA-B27 抗原。 q寻常型银屑病(PSV)与 GPP的关系可概括 为: v临床表现的包容性，即：二者皮损可共 存、转化。 v免疫异常的相似形，即：二者皮损处都 有CD4+ 、CD8+T细胞的浸润, IL-6、IL-8高 水平表达,白细胞聚集形成微脓肿。 v遗传背景的明显差异性(后述)。 q两种临床异质、遗传异质 GPP 亚型: v有PsV病史的GPP与无PsV病史的GPP。 vPsV阳性GPP发病年龄偏晚，诱发因素常 是先前的糖皮质激素治疗或不规则撤退 。 v PsV阴性GPP发病年龄偏早，诱发因素多 为上呼吸道感染 。 v遗传异质性后述。 qHLA复合系统 vHLA位与人6P21.31上,全长3600Kb,只占整个 人类基因组的1/3000,是人类基因组中最复杂 的遗传系统。 v目前已鉴定出224个基因座位,128个有功能性 产物表达,其中39.8%基因产物直接参与免疫 应答及调节。因而HLA系统多与免疫性疾病有 关。 v与疾病关联最密切的一区域，现已肯定50多 种疾病与HLA基因明显关联，即 HLA复合体与 疾病关联程度超过人类基因组任何一个区域 。 vHLA-DQB1位于HLA-II类基因DQ亚区，目前 已鉴定的DQB1等位基因达25个，对应的血 清特异性抗原只有9种，即25个等位基因 编码的抗原只有9种特异性。 vDQB1与DQA1分别编码DQ分子的链和链 。已发现DQB1等位基因与多种疾病关联。 最典型的例子是与IDDM的关联。如果DQ 链第57位氨基酸是D，则对IDDM呈抗性； 若为D以外的其它氨基酸，则表现为易感 性。 q研究HLA与疾病相关，实质上是研究疾 病发生发展的遗传倾向，因而属于病因 学研究。 q研究方法通常有关联分析和连锁分析 。 v关联分析是比较来自同一群体中无亲缘 关系的患病个体与非患病个体(对照)在 某一遗传标记位点(marker locus)上的 特定等位基因(如HLA等位基因)与疾病性 状的相关程度。一般通过患病人群和健 康人群作HLA分型后，用统计学方法(通 常用2-tesf)进行判别，故属于病例 对照研究，又称群体相关研究（ population association studies）。 v若发现标记位点的特定等位基因频率在 患病组与对照组之间有显著性差异，则 表明该特定等位基因与所研究的疾病性 状相关联，提示标记位点可能含有一个 疾病易感基因或与易感基因紧密连锁。 关联程度通过计算相对危险度 (relative risk,RR)来估计。 q关联分析结果的判定 v发现某种HLA等位基因或抗原与某种疾病 关联(有统计学意义)并不意味着携带该基 因就一定患病，关联结果有两种可能的解 释。 v一种可能：关联成分与疾病易感性有关( 原发关联)。 v另一种可能：关联成分与疾病易感性无关 ，而仅仅是遗传标记，但由于该基因位点 存在与HLA连锁不平衡的其他未知基因， 可能也造成机体对疾病易感。 v如HLA-DQB1*0405在IDDM发病中起关 作用，但此基因又与HLA-DRB1*0901 及HLA-B*4601呈连锁不平衡，使人 误认为HLA-DRB1*0901或HLA-B*4601 与疾病关联，实际上只有HLA- DQB1*0405属于该病的原发关联成分 ，其它2个等位基因属于次级关联。 q关联分析的实际意义 v关联分析可提示相关位点或特定的等位 基因的传递方式及效应性质。如正相关 ，促发病；负相关，保护不发病。并可 由亚型分析发现其遗传异质性(如I型与II 型银屑病)。 v 关联分析虽只能将致病基因粗略地定位 于某个位置，却能为以后的基因精确定 位、克隆等研究提供重要依据和线索。 qHLA的分型技术 v 血清学方法：只能检测HLA基因产 物即HLA抗原宽特异性，不能检测 HLA基因本身的多态性。 v 细胞学方法：由于分型细胞来源 困难，且只能检少数HLA-DW、HLA- DPW抗原，现已基本不用。 v分子生物学技术：即DNA水平的HLA分型 技术。可检出HLA多态性，可识别同一位 点的不同等位基因，随着PCR技术方法的 改进和发展，其精度和分辨水平越来越细 ，有助于深入研究HLA基因的结构和功能 。 v常用的方法：包括PCR-RFLP(限制性片段 长度多态性)、PCR-SSO(序列特异寡核苷 酸探针)、PCR-SSP(序列特异性引物)及 PCR-SBT(序列直接分型)等。 vPCR-SSP基本原理：PCR反应的特异性取 决于扩增引物与模板DNA的精确匹配。应 用SSP引物使HLA分型特异性转化为由PCR 反应特异性来决定，因为SSP引物序列与特 异性等位基因的核苷酸序列完全匹配，只 要控制好PCR反应条件，就使每对SSP仅能 扩增某一特异性HLA等位基因，扩增产物 通过琼脂糖电泳或荧光检测，便可测定其 特异性，从而达到对HLA等位基因分型的 目的；同时反应体系中加入了参照引物， 扩增HLA区域内一段保守序列，又可避免 假阴性结果。 vHLA与银屑病的相关性研究 vRussell(1972)首次报道了HLA-B17与 银屑病明显相关。 v银屑病与HLA的相关已明确，即至少 有一个银屑病基因位于HLA位点或在 附近。 v比较一致的意见认为:PsV与HLA-A1、 B13、B17、Cw6、DR7等相关。 vI型银屑病(40岁以前发病)主要表达HLA- Cw6、HLA-B57、HLA-DR7； vII型银屑病(40岁以后发病)则高度表达 HLA-Cw2。 v最近翟宁等发现HLA-DQB1*0602与东北汉 人PsV关。刘涛峰等则发现皖汉人PsV与 HLA-DQA1*0201明显相关。 v Dausset等(1977)首次报道了GPP与HLA- A13、B17、B27相关后， v Karvonen和 Zachariae等 随后证实HLA- B27与GPP强相关，与PsV不相关；从而首 次揭示了PsV与GPP的遗传背景具有差异 性。 v Ocklawaha等（1996）对日本541例GPP 的流行病学研究发现： v GPP与HLA-A2、B14、B35有弱相关； v PsV阳性的GPP与 HLA-A1、B37、DRw10 显著相关；PsV阴性的GPP不与它们相关 ， v 从而首次揭示PsV阳性的GPP与PsV阴性 的GPP 具有遗传异质性。 vOzawa等则首次从DNA水平上研究发现 HLA-DQB1*0303与PsV阴性的GPP显著相 关。 v进一步验证了PsV阳性的 GPP与PsV阴性 的GPP 的遗传异质性。 v我国只有宋芳吉报道北方汉族GPP患者与 HLA-B13显著相关， v国内尚未有HLA-II基因与GPP相关的研究 文献。 目 的 本文采用PCR-SSP技术，对山东籍汉 人GPP患者和健康对照进行HLA-DQB1 等位基因分型研究，目的在于 ： 1)探讨山东汉人GPP与HLA-DQB1等位基因 的相关性。从而从DNA水平上探讨GPP可 能的发病机制。 2) 获得山东汉人对GPP易感或保护的相关基 因。 3)验证PsV阳性GPP与PsV阴性GPP遗传异质 性；以及探讨GPP各临床类型的遗传背景 是否具有差 异性，从而为临床分型提供依 据。 4) 长远目的为研究中国汉人与GPP相关性提 供一 些遗传学数据。 材料与方法 q实验仪器与材料 DNA扩增仪 稳压电泳仪 紫外线分析仪 台式高速离心机 旋涡混合器 移液器(2l，20l，200l各一个) 序列特异性引物（SSP） PCR反应 Buffer TaqDNA聚合酶 q实验对象 v病例资料：38例GPP均来自1990年以来， 曾在我院住院治疗(包括多次住院)并确 诊的GPP患者和近2年来门诊新发现并 确诊的GPP患者，所有患者均为山东 籍汉族人，性别、年龄不限。 v对照资料：94例全部来自山东中医药大 学，山东籍汉族大学生及教职工自愿健 康献血员，彼此间无血缘关系，个体及 家族中无 银屑病及其病史。 q标本收集：病例及对照每人均采取周 围静脉全血2ml，置于含有ACD 0.5ml 塑料试管里，稍混匀加盖后，-80 超低温冰箱保存。 qDNA抽提：应用上海生工提供的抽提 试剂盒。 q PCR反应体系：每个PCR反应体系为25l。 其中含有10PCR Buffer 2.5ml；0.4 mol特异性引物；0.2 mol内对照引物； 200 mol的dNTP；1.5 mmol MgCl2；1 u Tag DNA酶；2l 模板DNA。 qPCR反应参数：第一步94预变性5 min。第 二步94 变性30 s55-60退火50 s72延伸30s32个循环。第3步72延 伸5min。第4步4保存2 h。 q读取及判断结果：每条泳道内必须出 现阳性对照带(796 bp)，在其前方对应 欲检测等位基因大小的位置出现明亮的 带时判为阳性；如果未出现阳性对照带 ，视为PCR反应不成功,需重新扩增。电 泳图象，见图-1，-2，-3，-4， M DQB1*0603、 0201、 0602 200bp 100bp M DQB1*0501、 0602 AC/GPP 无PsV史及家族史 200bp 100bp M DQB1*0602、 0303 成人GPP 有关节型银屑病史 200bp 100bp M DQB1*0603、0201 儿童GPP PsV、家族史阳性 200bp 100bp q统计学处理 v采用2检验：对患者组与对照组的HLA- DQB1等位基因逐一进行关联分析。应用 SPSS 10.0软件包，把相关数据输入计算机 计算出相关参数2、P和RR值。 v校正Pc(P correction)由Bonferrn法计算， 即PC = P所检测的等位基因数。 v以PC0.05作为显著性检验水准。 v等位基因频率(Allelic frenquency,AF)依 据Hardy-Weinberg平衡定律，由公式 AF=1-(1-antigen frequency )1/2计算，其 中antigen frequency为检测阳性数占检 测总数的百分数。 结 果 q临床情况 v一般情况：病例组38例，男26例，女12例 。发病年龄最小2月，最大72岁，平均29 岁；其中12岁以下发病的儿童8例。病程 最短21天，最长30年。PsV病史阳性18例( 包括1例关节型银屑病)，PsV病史阴性20 例。有PsV家族史9例。对照组94例，男59 例，女36例，平均年龄21岁。 v临床类型：Von Zumbusch型27 例；LGPP 6例；妊娠期GPP 3例；AC/GPP 2例； 8 例 儿童均为 Von Zumbush型。 v9例做病理检查，表现为角化不全，表皮 内中性粒细胞移入，角层下棘层上部 Kogoj微脓肿，棘层不同程度的肥厚；真 皮浅层血管扩张，周围淋巴细胞、中性粒 细胞浸润。 q 实验结果， 见： 表1 表2 表3 表4 表1 GPP患者与对照组 HLA-DQB1等位基因频率分布比较 等位 基因 患 者 组 对 照 组 n=38 n=94 2 P PC RR 频数 频率 频数 频率 DQB1*0602 11 0.157 10 0.055 DQB1*0603 11 0.157 7 0.038 DQB1*0604 1 0.013 23 0.131 DQB1*0201 15 0.222 7 0.038 6.78 0.009 0.117 3.42 10.6 0.001 0.013 5.06 8.674 0.003 0.039 0.08 19.98 0.0004 0.005 8.10 HLA- DQB1 等位基 因 PsV阳性 GPP(n=18)对照组(n=94) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 3 0.087 10 0.055 0.11 0.436 5.668 1.68 DQB1*0603 9 0.292 7 0.038 19.00 0.0004 0.005 12.42 DQB1*0201 13 0.472 7 0.038 38.91 0.0004 0.005 32.31 表2 PsV阳性GPP与对照组 基因频率分布比较 表3 PsV阴性GPP与对照组 基因频率分布比较 HLA- DQB1 等位基因 PsV阴性 GPP(n=20) 对照组 (n=94) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 8 0.225 10 0.055 8.60 0.003 0.039 5.60 DQB1*0603 2 0.051 7 0.038 0.00 0.657 8.541 1.38 DQB1*0201 2 0.051 7 0.038 0.00 0.657 8.541 1.38 HLA- DQB1 等位基因 PsV阳性 GPP(n=20) PsV阴性 GPP(n=20) 2 P PC RR 频数 频率频数 频率 DQB1*0602 3 0.087 8 0.225 1.50 0.160 2.08 0.30 DQB1*0603 9 0.292 2 0.051 7.37 0.007 0.091 9.00 DQB1*0201 13 0.472 2 0.051 15.35 0.0004 0.005 23.40 表4 PsV 阳性GPP与PsV 阴性GPP基因频率比较 讨 论 q本实验结果显示 vHLA-DQB1*0201、0603的频率在患者中显 著升高，与对照组比较均有显著性差异 (RR=8.10，PC0.01；RR=5.06， PC0.05)。 v表明携带DQB1*0201、0603这两个等位基 因的山东汉族人群患GPP的风险性高于其 他人群。 进一步分析： vDQB1*0201、0603多呈杂合态 表达(9/15，9/11)。 v而对照组无一例表达。 v表明杂合体(0201/0603)患GPP 的风险性最高。 vHLA-DQB1*0602的频率患者组较对照组也 明显升高(RR=3.42，P=0.009)，但校正后 无统计学差异(PC=0.117)。 v本研究认为扩大样本量后，可能会出现阳 性关联。 v依据是：DQB1*0201、0603、0602这3个等 位基因编码的DQ分子有共同的结构。 v如：Khandnja发现，96%抗dsDNA抗体阳 性的SLE患者携带DQB1*0201或DQB1*0602 ， v随后他发现这2个基因编码的DQ链第14 位aa都是甲硫氨酸，第26位都是亮氨酸 ，而其它DQB1等位基因在这2个位置的氨 基酸差异较大。 v提示这2个基因编码的抗原分子含有与致 病肽结合的共表位。 vHjelmstrom研究发现DQB1*0201、0603与 MG强相关。 v他采用同源模型技术构建出这2个等位基 因编码的DQ2和DQ6分子结构。 v提出了P7和P9 2个共同的可能的易感肽链 结合区。 v本实验对3份DQB1*0201阳性的扩增DNA测 序结果： v3份扩增DNA碱基序列在第30位都由正常的 T变为G。在第45位，2份由T变为G，1份由 A变为C。与人类基因库提供的氨基酸序列 比对，本实验在第21-23位的氨基酸序列 与正常比较差异较大。 v我们还不敢判定这些碱基和氨基酸的异常 与GPP关系有多大，但至少带给我们一点 启示。 v本实验显示，患者组中DQB1*0604的频率 明显低于对照组(RR=0.08，PC0.05)，表 明携带DQB1*0604的山东汉人患GPP的风 险性较小。 v国外研究表明，携带DQB1*0604的白人对 MG抵抗。 v但DQB*0604是否是山东汉人或国人对 GPP抵抗的保护性基因，有待于进一步研 究。 v通过以上分析，结合本科题研究。 v 推测：DQB1*0201、0603、0602这3个 等位基因编码的DQ2和DQ6分子链中 可能存在着与GPP易感的肽链结合区 。 q PsV阳性GPP与对照组比较 DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP 组中显著高于对照组(RR=32.31， PC=0.005；RR=12.42，PC=0.005)。 q PsV阴性GPP与对照组比较 DQB1*0602频率显著高于对照组(RR=5.6 ，PC=0.039)。 qPsV阳性GPP与PsV阴性GPP比较 DQB1*0201、0603的频率在PsV阳性GPP 组高于PsV阴性组（RR=23.4，PC=0.005； RR=9.0， P=0.00