流感病毒标本采集运输分离检测及注意事项课件

国家流感中心 张烨 标本种类 l临床标本 鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等 l血清标本 病人的急性期和恢复期血清双份血清 临床样本的选择 l采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例 流感样病例:发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者 ，而缺乏其它的实验室确定诊断依据 l 采集时间：病人发病后的头三天 采样液的要求 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液，Eagels细胞液 采集后应立即放入适当的采样液中低温保存 抗生素名称终浓度 庆大霉素0.1mg/ml 抗真菌素2Ug/ml 采样液的抗生素含量 临床标本的采集法 l鼻拭子 l咽拭子 l鼻咽吸取物 l漱口液 若采集的是鼻咽拭子，同一时间采集的标本可放入同 一管内 注意：采集禽流感疑似病人标本 最好是下呼吸道吸取物 临床样本收集的注意事项 操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护 采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物 采集标本要有一定力度 标本采集后应迅速至于冰上或者4 以下保存，因为流 感病毒对热很敏感 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别 ， 采样日期 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。 24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 或以下 血清学标本注意事项 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清 采集空腹血 l标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里 ，拧紧； l将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一 份标本； l在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封； l将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。 流感病毒临床标本的运送要求 新鲜的临床采集标本 应在4条件下24小时内运送至全国流感监测网络实验室; 未能24小时内送至实验室的，应置-70或以下保存 冻存的临床采集标本 应在冻存的条件下，低温送至实验室 v含聚丙烯纤维的拭子的采集标本:先将含聚丙烯纤维的拭子在 管壁反复挤压后取出 v鼻腔或咽部洗液的标本:充分振荡标本管，将粘液打碎。置4 待其自然沉淀510分钟，取上清5 ml。上清液可直接接种或 低温保存 临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份（40 ）用于鸡胚接种，一份（30）用于MDCK细胞 接种，一份（30）保存待复核用。对于病毒分离 阳性的标本70保存6个月 *14 样本采集 鼻咽拭子 或含漱液 双份血清 快速诊断 血凝抑制试验 或中和试验 分型鉴定 病毒分离 标本接种注意 l 最好24小时内进行病毒分离 病毒分离标本实验室的保存条件 l 24小时内进行病毒分离，4保存 l 24 48小时内不能进行病毒分离的70或以下保存 常采用鸡胚和MDCK细胞分离方法 流感病毒分离：生物安全二级实验室 禽流感病毒分离：生物安全三级实验室 正常细胞病变细胞 细胞分离流感病毒 选择敏感MDCK细胞 细胞7090成片 TPCK胰酶 7.5%BSA 鸡胚分离流感病毒 9日龄SPF鸡胚 尿囊腔和羊膜腔接种： 季节型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接种分离病毒 人禽流感病毒尿囊腔分离病毒 不同胰酶TCID50检测结果 MCDK细胞代数TPCK-胰酶普通胰酶 21代8.753.5 46代93.5 MDCK细胞敏感性试验结果 MDCK细胞代数TCID50 19代9 21代9 35代9.5 41代9 45代9 MDCK细胞TCID50检测结果 使用TPCT-胰酶, A/北京/西城/156/2006(H3N2) C4 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部 的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育 不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉 流感病毒操作要求生物安全规程 禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒 禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本 动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保 存 鉴定方法 l血清学方法 l红细胞凝集及凝集抑制试验 l神经氨酸酶活性及抑制试验 l其它方法 l核酸检测 l快速检测试剂盒 流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结 合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构 ，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分 。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。 当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑 制凝集现象出现 使用的试剂可靠无误 红细胞悬液浓度是否合适 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 选用标准抗血清是否准确 读取HA试验的结果是否正确 4个血凝单位是否准确 红细胞阴性对照 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确 实验方法优缺点 病毒组织培养（病毒分离）肯定 至少约5-7天 血清学检测 可靠 耗时 IF 或 EIA敏感性波动在40-100%，特 异性在86-99% RT-PCR方法 敏感特异，检出病毒的最小 量为0.01-0.1 TCID 50 荧光定量RT-PCR方法敏感特异，检出病毒的最小 量为0.006-0.02 TCID 50 ， 可定量分析 RT-PCR Real-Time PCR NASBA MDD RT-PCR 组成成分 *30 12345 22 55 72 94 时间（min） 温度 （） PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 *31 PCR反应流程图 灵敏度高 皮克(pg=10-12g)量级扩增到微克(ug=10-6g)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，24 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组 织的粗提DNA