《分子生物学常用技术在中医药研究中的应用》实验课 08 Northern blot(23P).ppt

实验 19 northern blotnorthern blot 1 目目 的的 1定量分析某一特定基因mrna的转录转录与否，以 及转录的水平水平。 2比较两个或两个以上不同组织某一已知基因已知基因转 录的差异。 3比较两个或两个以上不同组织某一未知基因未知基因转 录的差异。 2 由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点， 多年来一直深受广大研究者的喜爱。其结果可以同时 反映某一特定基因rna分子量的大小及其数量。在中 医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一已 知基因转录的调控作用。例如我们的gnrh、n-ras、 白蛋白等研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平 的和核酸水平的。两者的含量变化均与其生成、代谢 有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环 境条件等因素，这些变化采用观察蛋白与核酸的量是 不能回答的，所以对northern blot的结果要有客观的分 析。 类似的实验主要为rt-pcrrt-pcr。 3 原原 理理 采用变性凝胶电泳，使rna分子由小到大排列于 凝胶之中。应用虹吸原理，将rna转移至硝酸纤维素 膜，烘干，使rna牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与 放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的 探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影， 使胶片上出现对应于相应分子量mrna的条带。最后 ，对条带进行光密度扫描，并统计分析。 4 实验准备实验准备 （参考教材） 5 实验步骤实验步骤 1 1rnarna电泳电泳 取10ug rna旋转真空干燥，溶于20ul新配的样品 缓冲液。置样品于65水浴中5分钟，迅速移入冰中冷 却，再加4ul上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注 入电泳缓冲液1mops，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。 接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品24ul，注入上 样孔内。开启电源，电压调至100v。电泳约2小时，至 溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。 轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查 电泳结果。在凝胶一侧放把尺尺，拍照拍照。 6 2 2rnarna转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入20ssc，容器上缘架一水 平玻璃板。取24层滤纸，纸宽同凝胶长，纸长足以 经玻璃板两侧浸入20ssc中。待滤纸全都湿透后，滚 动移液管赶走滤纸间及其与玻璃板间的气泡气泡。切去凝 胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小 角，作为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管 赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁成凝胶 大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再 浸于20ssc中，取出平放于凝胶之上，缺角处与凝胶 缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的 气泡。膜上置24层20ssc浸湿的滤纸，用移液管赶 走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。 7 8 用4张保鲜膜保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃 和容器，以防止凝胶外形成虹吸短路虹吸短路，以及容器内的 缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺46厘米厚的卫 生纸，上置一平玻板，玻板上压一300300500500克克的重物 。过夜。 次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在透射紫 外灯仪上确认rna已全部转移至硝酸纤维素膜上。把 该膜夹于两张洁净的滤纸间，在80真空干燥箱中真 空干燥两小时。 9 3 3探针标记探针标记（此工作与膜转移于同一天进行） 水 14 ul olb 5 ul bsa （ 10mg/ml ） 1 ul dna （ 3050 ng ） 2 ul 1005min, 3710min, 45min 32pdctp （50uci） 2.5 ul 大肠杆菌聚合酶k片段 0.5 ul 混匀，4 过夜，次日再加： 大肠杆菌聚合酶k片段 0.5 ul 半小时后加入终止液 50 ul 10 4 4离心柱分离探针离心柱分离探针 （1 1）柱的）柱的制备制备 取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入 吸头，堵住出口，将混匀的sephadex g50（中号）移 入吸头至满。取1.5ml eppendorf管，剪去盖，放入 10ml离心管中。将蓝吸头插入eppendorf管，可自制一 套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距 1.5ml管底部约12厘米。1600g离心4分钟，弃去 1.5ml管中的te液，再用100ul te液加入小柱，离心， 如此反复两次平衡柱子。 11 （2 2）分离）分离 用镊子取出原1.5ml管，取一新的1.5ml管放入10ml 离心管，插上平衡过的小柱。将标记的探针液，加入 小柱，1600g离心4分钟，小心取出1.5ml管，将分离 的到的探针移入一标签过的1.5ml管，盖紧盖子。 12 5 5探针变性探针变性 将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性变性，迅速迅速 移入冰中冷却冰中冷却。 6 6杂交杂交 将硝酸纤维素膜在2ssc中浸湿，以防碎裂，然 后放入杂交袋中，四周封口，剪去一角注入10毫升预 杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于40水浴摇床中 摇晃预杂交1小时以上。取出袋，拭干，剪去一角，将 变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位 素的探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于40水浴 摇床中摇晃杂交过夜。 13 7 7洗膜洗膜 取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入50ml管 中，存于4冰箱，以备再用。剪去袋的四周，置此袋 于2ssc/0.1sds液中，取出膜，晃洗于此液。移膜 入新的2ssc/0.1sds液中，于50中晃洗半小时， 如此重复一次。 8 8曝光曝光 取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放x光 胶片于增感屏上，再放上膜，盖上盒，将片盒存于- 70冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长 曝光时间。 14 实验结果实验结果 1电泳后，凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚 地见到18s、28s两条明显的橘红条带，以及前后不等 强度的橘红显色。 15 2x光胶片上可见杂交带。杂交背景低。 3如果比较不同样品的话，可能会见到在同一分 子量的区域见有曝光深浅不等的杂交带，为了准确定 量，可以借助于激光光密度计扫描分析。 16 注意事项注意事项 1本方法采用同位素标记，整个实验过程中务须 严格遵守同位素同位素操作规则，注意安全。 2实验过程中，由于rna容易被rna酶降解，因 此，要注意无菌操作，以防rna酶污染。 3硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中，不要被污 染与破碎，更不能直接用手拿，而应用扁平摄子小心 摄取。 4在使用虹吸法将rna转移至硝酸纤维素膜上时 ，要注意将气泡排除干净，并且用保鲜膜封好凝胶四 周，以免形成短路，使转移失败，这样的事例不少见 。 17 5含有rna的硝酸纤维素膜80干燥后，如果实 验必须中断，可将硝酸纤维素膜用保鲜袋包好，保存 于-20冰箱中。 6如果作某一基因表达的半定量分析，可以同时 或分别与内参基因探针杂交，以明确不同样本的上样 量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光 密度的比值作为半定量参数，进行统计分析。 7硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交 。洗去探针的方法如下： 把硝酸纤维素膜置于70的0.1ssc/0.1sds中 晃洗20分钟，弃去此液，如此条件洗3次。通常一张膜 可以反复杂交3次以上。 18 8用于northern blot实验中固定rna的材料主要 有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝酸纤维素膜具有成 本低、杂交信号本底较低等优点；同时，也有对结合 力不够强、重复使用的次数不多等缺点。而尼龙膜具 结合力强、可反复使用等优点；却有成本高、杂交信 号高等缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用 。 19 9用于核酸杂交的分子探针有dna探针、cdna 探针、rna探针以及人工合成的寡核苷酸探针等多种 。northern blot技术最合适的探针为cdna探针。如果 选用基因组dna探针时，要尽可能使用基因的编码序 列（外显子部分）作为探针，而避免使用内含子及其 它非编码序列，否则探针中可能因高度重复序列存在 引起非特异性杂交而出现假阳性结果。rna探针因为 操作不方便，常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基 因点突变分析，但是由于这类探针分子量小，标记后 不容易纯化，往往给实验带来困难。 20 10用于核酸杂交的分子探针的标记物标记物有同位素 、生物素、地高辛、荧光素等。其中，同位素是目前 国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有 灵敏度高、特异性强、杂交本底低等优点。而且，其 曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验 结束，膜经洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点 。 21 11探针的同位素标记方法有多种，其中缺口平缺口平 移移法与随机引物随机引物法最为常用。采用缺口平移法标记同 位素时，使用的标记物应在脱氧核三磷酸的-磷酸位 上；所使用的dnase i 浓度