糖尿病肾病肾损伤机制的研究进展（苏宁教授）课件

糖尿病肾病肾损伤机制的研究进展 肾脏局部微环境浅析 苏 宁 广州中医药大学西医基础公共实验室 题 纲 l糖尿病肾病概述 临床分期；肾脏的病理变化；肾脏功能障碍及结构损害 的基础 lDN时肾损伤机制的研究进展 TGF-/Smads信号转导系统 TGF-下游因子 肾脏微环境中复杂的生物活性物质网络 糖尿病肾病概述 l糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是指 糖尿病（diabetes mellitus，DM）时发生的肾 小球、肾小管、肾间质和肾血管病变。 l近年来发现除糖尿病直接引起的肾脏病变外，糖 尿病患者常伴发多种与糖尿病无直接关系的肾脏 疾病，统称为糖尿病肾脏疾病（Diabetic kidney disease，DKD），其概念范围较DN更广 。 DN的临床分期 根据Mogensen分类，DN五期分别是： l（1）肾脏肥大，肾小球高滤过期 l（2）肾损害无临床表现期 l（3）微量白蛋白尿期 l（4）临床DN期 l（5）肾衰期 DN进程中第1、2期为临床前期，不属于临床DN诊断 。 病人出现持续微量白蛋白尿表示开始进入DN进展期。 DN时肾脏的病理变化 l根据Mogensen分类，DN早期即可出现肾脏肥大，主要 由于高灌注引起的肾小球毛细血管扩张所致，肾脏无 器质性损害；肾脏的器质性损害多发生于病程5年以 上（即DN第2期后）的DM患者。 l但有人观察了11例病程在14年的1型DM患者的肾穿 刺标本，电镜下已可观察到GBM有节段性增厚和足突 节段性融合。提示DN的肾脏形态损伤出现早于功能障 碍，且进行性加重，贯穿DN整个过程。 l肾小球肥大，肾小球基底膜（glomerulus basement membrane，GBM）和肾小管基底膜（tubule basement membrane，TBM）增厚，肾小球系膜基质增多，肾小 球无细胞性结节状硬化，肾小囊玻璃滴状病变，肾小 球毛细血管袢的纤维素样或类脂样帽状病变及肾小球 毛细血管微血管瘤形成。 lDN的主要病变是细胞外基质增生，所以又被称为糖尿 病肾小球硬化症（Diabetic glomerulosclerosis） ，是糖尿病导致肾损伤致终末肾病的主要原因。 DN时肾脏的病理变化 动物DN病理变化 l人和啮齿类动物在DN病理上的相同之处是均有肾脏 肥大、弥漫性和渗出性肾小球病变，GBM增厚，系膜 基质扩张和系膜细胞增生。 肾小管上皮细胞空泡变 和颗粒变性、TBM增厚、间质纤维化及巨噬细胞浸润 均与人类肾脏改变相似。 l但啮齿类动物缺乏结节性肾小球病变和出入球小动脉 的玻璃样变。 DN时肾脏功能障碍及结构损害的基础 l DN的肾功能障碍主要表现为GFR降低致代谢产物排泄障 碍、滤过膜对大分子蛋白质的通透性增加致大量蛋白尿 产生。DN的肾脏结构损害主要是基底膜增厚、系膜扩张 ，继而出现肾小球、肾小管、间质纤维化，最终导致肾 脏结构严重破坏，功能极度减退。肾脏的功能障碍与结 构损害在DN的进程中互为因果、相互促进。 l大量研究证实，DN时肾脏功能及结构变化的基础主要是 细胞外基质过度积聚及足细胞结构、功能障碍。 细胞外基质过度积聚 细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分主要为 ： 透明质酸（hyaluronic，HA） 层黏连蛋白（lamminin，LN） IV型胶原(type IV collagen，IV-C) 纤维连接蛋白（fibronectin，FN）。 ECM在肾小球、肾小管的过度积聚可导致基底膜增厚、系 膜区增宽、间质纤维化，最终导致肾硬化。 ECM过度积聚的原因 ECM过度积聚的原因有生成增多和降解减少两方面。 l肾小球系膜细胞（glomerulus mesangial cell，GMC ）是合成和分泌ECM的主要细胞。 l目前研究较多的与基质降解有关的酶是基质金属蛋白 酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMPs由系 膜细胞、滤过膜内皮细胞及肾小囊壁层上皮细胞、肾 小管上皮细胞、浸润的巨噬细胞等合成和分泌，以非 活性酶的形式存在于细胞周围。 足细胞的变化 l肾小球脏层上皮细胞又称足细胞(Podocyte)，是一种终 末分化多突状细胞，通过足突固定在基底膜上。两相邻 足突间的裂隙称为裂隙孔，其上有裂隙隔膜，构成肾小 球阻挡血浆大分子物质滤过的孔径屏障。足细胞表面覆 盖着由涎酸及硫酸蛋白多糖所组成的阴离子衣，是肾小 球电荷屏障重要组成部分。 lDN时足细胞的损伤形式包括数量减少、密度减低、足 突扁平融合、以及足细胞上各蛋白表达的异常，进而破 坏足细胞孔径屏障及电荷屏障，导致蛋白尿发生、肾小 球硬化。 l造成DN发生与发展的因素较为复杂，主要分为遗传因素 和非遗传因素。 l遗传因素主要与基因多态性相关。 l非遗传因素包括代谢、血流动力学以及相关细胞因子的 异常变化。 DN时肾损伤机制的研究进展 高血糖 代谢紊乱AGEs增加血流动力学异常 相关细胞因子合成、释放重要信号传导通路活化 ECM合成增加、 降解减少 足细胞相关 蛋白缺失 肾小管重吸收 功能障碍 肾脏结构损害及功能障碍 氧化应激状态、局部炎症改变、肾素血管紧张素系统、血管紧张素与蛋白激酶的相互作用 肾脏局部微环境中的细胞因子网络 l几乎所有肾脏固有细胞，包括系膜细胞、上皮细胞、 内皮细胞等，均具有产生细胞因子的能力，并且同时 又是细胞因子生物学作用的靶细胞。 l组织细胞，包括肾脏细胞产生的细胞因子主要通过旁 分泌或自分泌形式在其生成的微环境中直接发挥作用 ，但在某些情况下也可进入循环，引起全身性效应。 l大量研究显示，糖尿病的高血糖状态可激活肾脏许多 局部细胞因子，目前的研究发现这些物质与DN的发生 发展有密切关系，其中以TGF-为复杂细胞因子网 络的中心因子。 TGF-信号转导系统 l转化生长因子(transforming growth factor-， TGF-)最早是由Delaro和Todaro于1978年在研究病毒 转化细胞过程中发现的，哺乳动物主要有TGF-1、2 、3三种形式。肾脏TGF-1表达最多，主要在肾小管 上皮和肾小球。TGF-受体(TR)有5种不同类型(- 型)，其中、两型受体的胞质区段有丝/苏氨酸 激酶活性，与受体后细胞内通讯有关。 l大量实验及临床研究发现，在糖尿病病人和实验型糖 尿病动物的肾脏、血液和尿中TGF-水平均升高。DN 时肾脏GMC合成TGF-1增多已基本成定论，同时认为 糖尿病早期的肾小球肥大是TGF-1介导的。 TGF-在DN进程中的主要作用 lTGF-通过受体信号传递发挥以下生物学作用： 调节细胞增殖和分化。TGF-抑制大多数肾细胞（如 肾近曲小管上皮细胞、肾小球脏层上皮细胞和肾小球 毛细血管内皮细胞）的增殖和分化，对于来源于间质 的细胞（如系膜细胞、成纤维细胞）能同时产生促进 作用或抑制作用。此外，TGF-还可以通过增大细胞 直径造成细胞肥大。 增加ECM蛋白含量。TGF-可增加、IV型胶原、 FN和蛋白多糖的合成，并抑制其降解。 参与炎性反应、组织修复、胚胎发育和免疫调节过程 。 TGF-/Smads信号通路的激活 lTGF-与受体TR结合后的信号转导与一组信号蛋白 Smad蛋白有关。Smad蛋白是目前所知TGF-受体的胞 内激酶底物，介导了TGF-的胞内信号转导。目前， 在哺乳动物已分离鉴定的Smad蛋白有9种（Smad1-9） ，Smad2、3参与TGF-信号传导，Smad4是TGF-家 族各类信号传导过程中共同需要的介质。 lDM时肾脏存在着TGF-/Smads信号通路的激活。高糖 可能是引起TGF-/Smads信号通路激活的原因之一。 TGF-/Smads信号通路对ECM合成及降解的影响 lTGF-可促进ECM各蛋白成分合成并阻止其降解。 lTGF-可通过Smads信号通路刺激多种基质蛋白的基因表 达。 lTGF-可通过阻止MMPs的合成和刺激TIMPs的产生来阻止 基质降解。 TGF-/Smads信号通路介导足细胞凋亡的作用 l体内和体外研究均发现TGF-可通过激活p38MAPK和 上调Smad7来诱导足细胞的凋亡。p38MAPK被激活后可 使哺乳动物细胞凋亡的关键酶caspase-3活性增加， 而Smad7可通过抑制抗凋亡因子NF-B的活性来加强 TGF-诱导的足细胞凋亡作用。 高糖等因素 TGF- Smads激活 ECM合成增加 降解减少 足细胞凋亡 ？ ？ TGF-下游因子结缔组织生长因子 l结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）通过免疫组化技术在正常大鼠和人肾小 球检测不到，在DN时表达上调。 l实验发现，db/db大鼠的GMC在暴露于TGF-、高糖等情 况下，明显诱导CTGFmRNA表达增加。肾近端小管上皮细 胞中也发现TGF-能诱导CTGF合成，且抗CTGF抗体及 CTGF反义寡聚脱氧核苷酸均能抑制TGF-诱导的ECM蛋 白合成。故有人认为CTGF与TGF-的关系密切，CTGF是 TGF-的下游分子，在促进肾脏纤维化中具有重要作用 。 TGF-下游因子结缔组织生长因子 lCTGF通过自分泌、旁分泌途径发挥以下生物学功能： 促进细胞趋化、增殖。CTGF能促进间质来源细胞(间质 成纤维细胞、肾小球系膜细胞)从G0期进入G1期，但阻 止细胞从G1期过渡到S期，且对成纤维细胞有强烈的趋 化作用，从而导致系膜区细胞增殖和成纤维细胞积聚。 提高ECM含量，诱导基质沉积。CTGF能促进多种ECM蛋 白成分如型、型、IV型胶原和FN的合成，促进5 整合素表达而增强细胞与基质相互作用，促使TGF-以 无活性的前体蛋白形式分泌而扩大上述效应。CTGF的众 多生物学作用类似于TGF-。 l血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）B链被认为是TGF-的下游介质，用可 溶性PDGF-B受体阻滞剂可以减少系膜细胞增生和ECM沉 积。糖尿病时，葡萄糖在早期引起TGF-1转录升高是 通过p38MAP激酶活化，另外，葡萄糖引起PDGF-B依赖 性TGF-1翻译水平升高，是通过增加细胞内PDGF的敏 感性完成。这解释了临床上血糖控制不好的糖尿病患 者可导致DN的进行性发展的现象。 TGF-下游因子血小板源性生长因子B链 高糖等因素 TGF- Smads激活 ECM合成增加 降解减少 足细胞凋亡 ？ CTGF PDGF DN时肾脏微环境中复杂的生物活性物质网络 l细胞因子网络 l蛋白激酶信号传导系统 l肾素血管紧张素系统 l肾脏局部炎症反应 l肾脏局部氧化应激反应 肾素血管紧张素系统 l肾素血管紧张素系统（renin angiotensin system， RAS）由肾素、血管紧张素(Angiotensin，Ang) 、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、Ang以及血管紧张素受体（ angiotensin receptor，ATR）等成分组成。对机体心 血管系统的调节、水盐平衡及内环境自稳态的维持有重 要作用。 l随着分子生物学技术的进展，证实了肾组织存在其自身 的RAS，通过旁分泌作用调节肾小球滤过、肾小管重吸 收及系膜细胞增殖、收缩等功能。 lDN时肾脏Ang活性增高 Ang与TGF-1 l在DN时，异常的葡萄糖代谢是导致TGF-1升高的主要 因素，此外RAS亢进使Ang产生过多也是引起高血糖 状态下TGF-1表达增加的另一重要因素。Ang可以 通过增强TGF-启动子的活性上调TGF-mRNA的表达 ，通过诱导TGF-1产生而增加ECM合成。 lAng不仅可以上调TGF-1表达，还可促进细胞新合 成释放的TGF-1活化。 蛋白激酶C信号传导系统 l蛋白激酶C（protein kinase，PKC）是l977年Nishizuka 发现的可被Ca2+/磷脂激活的一类丝/苏氨酸激酶，由多 种不同结构不同生物特性的同工酶（亚型）组成。PKC各 亚型在信号传导和功能上有特异性，其短期效应包括激 素、神经递质及细胞因子的释放，离子通道的转运，代 谢调节，细胞收缩及免疫和炎症反应；长期效应包括调 节基因表达，蛋白质合成，细胞增殖分化。 lPKC静息状态下主要以无活性的形式存在于胞浆中，受到 外界刺激时受其特异性底物蛋白吸引自胞浆向胞膜转移 。PKC的膜转移现象为PKC激活的重要标志。 蛋白激酶C信号传导系统 lPKC的活化有多条途径，DM时主要通过从头合成二脂酰甘 油（diacylglycerol，DAG）途径活化PKC。DAG是体内最 主要的内源性PKC激动剂。 lDM时激活的PKC通过其下游事件参与DN的发生发展：磷 酸化磷酯酶A2，使NO产生增多，扩张血管，参与肾小球 早期高滤过。磷酸化肌动蛋白结合蛋白，降低细胞与 细胞间、细胞与基质间连接，从而增加肾小球血管内皮 细胞通透性，发生蛋白尿。PKC可促进TGF-表达上调 。 Ang与PKC lAng通过其受体AT1激活酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK），TK通过一系列生化途径促使DAG激活 PKC。Ang激活PKC后又可以通过增加近端小管重吸收 葡萄糖来促进高糖激活PKC能力。也就是说，高糖和 Ang对PKC可有协同刺激作用。 PKC与TGF-1 lPKC可使Smad2和Smad3 MH1结构域磷酸化，而MH1结构 域是Smad与DNA直接结合的部位，这提示PKC有影响TGF -1/Smad信号通路的作用。 核转录因子-B l核转录因子-B（Nuclear Factor Kappa B，NF-B） 最早于1986年Sen和Baltimore在分析B淋巴细胞核提取 物中发现的一种核蛋白因子，它能与免疫球蛋白链基 因的内源性增强子B序列特异性结合，因而得名。NF- B在组织细胞中广泛存在，肾小球系膜细胞、毛细血 管内皮细胞、肾小管上皮细胞和经血液循环进入肾脏的 免疫细胞都存在NF-B转录调控。 核转录因子-B l细胞在静息状态下，NF-B 与其细胞内抑制性蛋白IB 结合形成NF-B/IB复合物，以非活性形式存在于细胞 浆中，当细胞受到内外刺激后，IB磷酸化，使NF- B/IB复合物解离，随后NF-B进入细胞核内与特异 性基因启动子或增强子区域“5-GGGRNYYCC-3”（B序 列）结合，启动或调节基因的转录。有DNA结合活性的NF -B都是一个二聚体，其中研究最多的是p50/p65二聚体 。 lDN时NF-B可被多种因素异常激活，如PKC及ROS途径 核转录因子-B lNF-B可从分子水平调节许多信号传导系统的功能， 主要包括：介导炎症反应；NF-B可高效诱导各种 细胞因子（如IL-2、IL-6、INF-）、黏附因子（ ICAM-1、VCAM-1）、趋化因子（MCP-1、C3），调控参 与炎症反应放大与延续的多种酶。参与细胞增殖和 凋亡；研究发现56，细胞周期蛋白Dl（cyclin D1） 启动子含有2个NF-B结合位点，NF-B活化具有促进 cyclin D1表达及G1/S期转换的功能，导致细胞周期调 节失控，细胞表现为无限增殖和自主分裂。所以激活 GMC中的NF-B可明显促进GMC增殖。 Ang与NF-B l研究发现血管紧张素原基因