猪伪狂犬病课件_1

猪伪狂犬病猪伪狂犬病 吕茂杰吕茂杰 2010.10.12010.10.1 猪伪狂犬病猪伪狂犬病 (Porcine pseudorabies(Porcine pseudorabies，PR)PR) PRPR是由是由伪狂犬病病毒伪狂犬病病毒引起的引起的一种急性传染病。一种急性传染病。临床上临床上 以以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征。发热、奇痒及脑脊髓炎为特征。 感染猪的特征感染猪的特征为为体温升高体温升高，新生仔猪新生仔猪表现神经症状表现神经症状， 还可侵害消化系统。还可侵害消化系统。成年猪成年猪常为常为隐性感染隐性感染，妊娠母猪妊娠母猪感染可感染可 引起流产、死胎和呼吸系统症状引起流产、死胎和呼吸系统症状，无奇痒。，无奇痒。 PRPR广泛流行于世界各国，广泛流行于世界各国，2020世纪世纪9090年代末，我国有扩年代末，我国有扩 大流行趋势。大流行趋势。 病原学病原学 n n 猪伪狂犬病病毒猪伪狂犬病病毒( (Pseudorabies virusPseudorabies virus , PRV ) , PRV )，又称，又称猪猪 疱疹病毒疱疹病毒型型为为疱疹病毒科疱疹病毒科的成员之一。病毒颗粒直的成员之一。病毒颗粒直 径约径约150nm150nm的有囊膜病毒，衣壳呈的有囊膜病毒，衣壳呈2020面体立体对称，面体立体对称， 内有线状卷轴样基因组，是单分子双股线状内有线状卷轴样基因组，是单分子双股线状DNADNA； n n PRVPRV只有只有一个血清型；一个血清型； n n PRVPRV的毒力由几种基因协同控制的毒力由几种基因协同控制，主要有，主要有gEgE、gDgD、 gIgI和和TKTK基因基因； 培养特性培养特性 n本病毒具有泛嗜性，能在多种组织细胞内增殖，但表现的敏感度 不同，其中以兔肾和猪肾细胞（包括原代和传代细胞系）最适于 病毒的增殖，病毒引起的细胞病变明显。开始呈现散在的病灶， 随后逐渐扩展，直至全部细胞溶解脱落；细胞病变最明显的时期 为接种后48-96h。 n兔肾和猪肾细胞最适于做蚀斑试验，可根据蚀斑大小和形状来对 病毒株进行鉴定；强毒株大多形成小而不规则的蚀斑，弱毒株的 较大，弱毒疫苗株的最大，直径可达8-10mm； n本病毒还可以在猴、牛、羊和犬的肾细胞，家兔、豚鼠和牛的睾 丸细胞，Hela细胞，鸡胚和小鼠成纤维细胞等多种细胞内增殖； n应用鸡胚做绒毛尿囊膜接种，强毒株于接种后3-4d在绒毛尿囊膜 表明出现较大而隆起的痘泡样病变和溃疡；随后因严重侵袭神经 系统，导致鸡胚死亡，死亡鸡胚主要变化弥漫性出血和水肿，尤 其以头盖骨表面皮肤的出血，局部呈突起状； 流行病学流行病学 n n 易感动物：易感动物：可自然感染猪可自然感染猪、牛、羊、犬、猫、貂、牛、羊、犬、猫、貂、 狐狸及鼠类狐狸及鼠类等各种动物。等各种动物。 n n 4 4周龄内仔猪感染此病，病情严重，死亡率高周龄内仔猪感染此病，病情严重，死亡率高 n n 成年猪多隐性感染，怀孕母猪感染可发生流产或死成年猪多隐性感染，怀孕母猪感染可发生流产或死 胎胎 n n 传染源：传染源：病猪、带毒猪以及带毒鼠类病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传为本病重要传 染源。染源。 n n 传播途径：传播途径：直接接触传播、消化道传染、经皮肤伤直接接触传播、消化道传染、经皮肤伤 口、呼吸道也可传播口、呼吸道也可传播PRVPRV。 n n 猪配种时可传染本病。妊娠母猪感染猪配种时可传染本病。妊娠母猪感染PRVPRV时，常可时，常可 侵害子宫内的胎儿，引起流产、死胎等。侵害子宫内的胎儿，引起流产、死胎等。 发病季节发病季节- -寒冷季节（有利于病毒存活）寒冷季节（有利于病毒存活） 临床症状临床症状 n n 母猪群出现繁殖异常母猪群出现繁殖异常，妊娠母猪发生流产、死产、木，妊娠母猪发生流产、死产、木 乃伊胎，其中以产死胎为主。乃伊胎，其中以产死胎为主。 n n 引起新生仔猪大量死亡引起新生仔猪大量死亡（第（第2 2天发病，天发病，3-53-5天达高峰）天达高峰） ，特别是一周龄内仔猪发病率及死亡率几乎，特别是一周龄内仔猪发病率及死亡率几乎100%100%；断奶仔猪断奶仔猪 死亡（发病率死亡（发病率20-40%20-40%，死亡率，死亡率10-20%10-20%）。 n n 断奶仔猪群及育成猪群出现中枢神经系统病损综合征断奶仔猪群及育成猪群出现中枢神经系统病损综合征 候群候群，呼吸器官感染症和腹泻症剧增。，呼吸器官感染症和腹泻症剧增。 病理变化病理变化 肾脏表面针尖大出血点肾脏表面针尖大出血点 肺水肿、出血肺水肿、出血 肝脏坏死灶肝脏坏死灶 脑膜充血、出血脑膜充血、出血 扁桃体坏死扁桃体坏死 诊断诊断 (1)(1)动物接种：动物接种：可采取病猪的扁桃体、大脑、肺脏、脾脏可采取病猪的扁桃体、大脑、肺脏、脾脏 为病料，用生理盐水或为病料，用生理盐水或PBSPBS制成制成10%10%悬液，经离心后取上清液悬液，经离心后取上清液 接种于家兔皮下或接种于家兔皮下或小白鼠脑内小白鼠脑内，家兔经家兔经25d25d或小白鼠经或小白鼠经210d210d 发病死亡，死前大多数家兔及小白鼠的注射部位发生剧痒和四发病死亡，死前大多数家兔及小白鼠的注射部位发生剧痒和四 肢麻痹肢麻痹。 (2)(2)鸡胚接种：鸡胚接种：取上述上清液接种于取上述上清液接种于911911日龄鸡胚绒毛尿日龄鸡胚绒毛尿 囊膜，经囊膜，经34d34d后形成特征性痘疱样白斑，死亡的鸡胚神经系后形成特征性痘疱样白斑，死亡的鸡胚神经系 统出血导致胚胎颅腔突出。统出血导致胚胎颅腔突出。 (3)(3)血清学方法：血清学方法：免疫荧光试验、琼脂扩散试验、病毒中免疫荧光试验、琼脂扩散试验、病毒中 和试验、补体结合试验、和试验、补体结合试验、ELISAELISA和和乳胶凝集试验乳胶凝集试验等。等。 家兔经家兔经25d25d或小白鼠经或小白鼠经210d210d发病死亡，死前大多数家兔及发病死亡，死前大多数家兔及 小白鼠的注射部位发生剧痒和四肢麻痹小白鼠的注射部位发生剧痒和四肢麻痹 乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病血清抗体乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病血清抗体 阳性反应 阴性反应 狗对伪狂犬非常敏感，因而可以作为伪狂犬病的信号 以无故失踪或死亡为特点 病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定 病毒的分离病毒的分离 采集病料：采发病畜的脑组织和扁桃体；采集病料：采发病畜的脑组织和扁桃体； 病料处理：病料处理：将组织研碎，冻融，用将组织研碎，冻融，用PBSPBS洗液制成洗液制成10%10%悬液；经悬液；经 2000rmp/min2000rmp/min离心，取上清作为感染动物或细胞培养物的接种材料；离心，取上清作为感染动物或细胞培养物的接种材料； 猪肾继代细胞系（猪肾继代细胞系（PK15)PK15)以及兔、猪和牛的原代肾细胞最适于以及兔、猪和牛的原代肾细胞最适于 本病的分离培养；长成单层的细胞，接入细胞培养体积本病的分离培养；长成单层的细胞，接入细胞培养体积10%10% 的组织悬液，于的组织悬液，于3737作用作用1h1h，使病毒吸附，然后以维持液，使病毒吸附，然后以维持液 补足液量，继续培养，一般当样品病毒含量高时，于补足液量，继续培养，一般当样品病毒含量高时，于18h18h开开 始出现细胞病变，但多数在接毒后始出现细胞病变，但多数在接毒后48h48h出现细胞病变，病毒出现细胞病变，病毒 浓度低时，需要浓度低时，需要96h96h以后。此时将细胞培养物做以后。此时将细胞培养物做HEHE染色，镜染色，镜 检可发现嗜酸性核内包涵体。检可发现嗜酸性核内包涵体。 n祁 贤等（2002）从上海某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒该毒株能在 鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK-21、ST 、Marc-145、PK-15细胞上增 殖并产生细胞病变，接种结果表明接种这些细胞的CPE相似；并利用BHK -21对该毒株进行了纯化；分离毒经3次蚀斑克隆后在BHK-21细胞上产 生较为规律的细胞病变一般在12 h出现病变2436 h病变细胞可达80 % ； n江焕贤等（1993）利用兔肾传代细胞和乳兔肾原(或传)代细胞分离了京A 株（接毒后20h左右出现病变）； n黄伟坚等（2000）分离了桂W株，利用RK细胞分离，接种细胞在24h左右 出现病变，48h达到80%以上； n韩伟等（2009）利用PK-15和BHK-21分离了伪狂犬病毒； n王永贤等（1984）利用IBRS和RK细胞分离了PRV； 也可应用也可应用9-11d9-11d鸡胚作绒毛尿囊膜接种鸡胚作绒毛尿囊膜接种感染鸡胚常在绒毛感染鸡胚常在绒毛 尿囊膜上出现白色痘斑样病变，并侵袭神经组织，导致胚胎头尿囊膜上出现白色痘斑样病变，并侵袭神经组织，导致胚胎头 盖骨突起等病变；盖骨突起等病变； 家兔人工感染家兔人工感染腹侧皮下接种，通常接种后腹侧皮下接种，通常接种后36-48h36-48h，注射部，注射部 位出现剧痒，动物啃咬，直至掉毛，破损和出血；位出现剧痒，动物啃咬，直至掉毛，破损和出血； 病毒鉴定病毒鉴定 通过形态结构，理化学和培养特性；中和试验；通过形态结构，理化学和培养特性；中和试验；IFAIFA试验；抗试验；抗 体检测（体检测（ELISAELISA；乳胶凝集试验等），分子生物学手段。；乳胶凝集试验等），分子生物学手段。 防制防制 n n （1 1）引进无本病的健康种猪）引进无本病的健康种猪，并经严格隔离检疫，并经严格隔离检疫. . n n 消灭鼠类、吸血昆虫和野生动物等传播媒介。消灭鼠类、吸血昆虫和野生动物等传播媒介。 n n （2 2）免疫接种）免疫接种 免疫程序免疫程序 n n 生长猪生长猪1010周龄首免，周龄首免，4 4周后二免；后备公母猪配种前周后二免；后备公母猪配种前3-43-4周免周免 疫疫1 1次（灭活苗）：公猪每年免疫次（灭活苗）：公猪每年免疫2 2次，母猪产前次，母猪产前4 4周免疫周免疫1 1次次 ；断奶仔猪断奶仔猪2-42-4月龄可接种活疫苗或灭活苗月龄可接种活疫苗或灭活苗。 n n 最好使用多基因缺失疫苗，母猪注射免疫，最好使用多基因缺失疫苗，母猪注射免疫， 新生仔猪滴鼻免疫，哺乳仔猪断奶仔猪注射新生仔猪滴鼻免疫，哺乳仔猪断奶仔猪注射 免疫。免疫。 猪伪狂犬病疫苗的研究进展猪伪狂犬病疫苗的研究进展 灭活疫苗 将分离的伪狂犬病病毒强毒用BHK- 21 细胞或IBRS- 2等 传代细胞培养，当病毒的增殖滴度达到要求时收获病毒灭 活后加入油乳剂而制成灭活苗。 国内：鄂国内：鄂A A株，川株，闽株，川株，闽A A株等株等 自然弱毒疫苗 n自然弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的反复传代，或在某些诱（突） 变剂的存在下，用高于通常的培养温度在细胞培养物上反复继代获得， 其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种天 然的基因缺失疫苗。 n在20 世纪60 年代后，许多国家用不同的方法培育了不少伪狂犬病弱毒 疫苗株，其中应用较为广泛的主要是匈牙利的Bartha 株、罗马尼亚的 Bucharest 株和BUK 株等。 nBartha 弱毒株是由匈牙利学者Bartha 于1961 年分离，并经猪肾、鸡 胚反复传代致弱的一个疫苗株（缺失gE和gI基因）。 nBucharest 株系罗马尼亚布加勒斯特兽医所通过将伪狂犬病强毒株在鸡 胚尿囊膜上培养至200 代后，获得的弱毒株。用鸡胚培养后制成的冻干 苗，仅适用于9 日龄以上的仔猪和妊娠2 月龄的母猪。 这些毒株主要毒力基因TK没有缺失，故其毒力有很大返强的可能性，并可 能导致疾病的流行。 基因缺失疫苗 n伪狂犬病毒基因缺失疫苗的研制始于20 世纪80 年代初期，即是利用 基因工程技术在PRV 基因组中插入或缺失一段序列致使PRV 的某些 基因不能表达，从而致弱PRV，同时又保持其较强的免疫原性; n其中缺失的基因主要是伪狂犬病毒的毒力基因胸苷激酶（TK）、蛋 白激酶（PK）、核苷还原酶（RR）和脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase ）基因以及一些具有免疫原性的糖蛋白gG、gE、gC、gD 基因等。 n目前据此已成功构建了以缺失主要毒力基因TK 基因为代表的 单基因缺失、双基因缺失和多基因缺失疫苗。 n n 目前国内其他厂家生产以及进口的伪狂犬病活疫苗目前国内其他厂家生产以及进口的伪狂犬病活疫苗几乎都是几乎都是BarthaBartha株株 （该毒株属于伪狂犬病弱毒疫苗株）（该毒株属于伪狂犬病弱毒疫苗株） n四川农业大学生物技术中心，在国内率先系统地对PRV 的 分子生物学进行了研究，并在国内首次构建了PRV Fa 株 TK 基因缺失疫苗株，并对其免疫原性和保护力等进行了 研究。目前以TK基因缺失疫苗为主。 n方六荣等（2001）以分离鉴定的猪伪狂犬病病毒鄂A株为 亲本，LacZ 基因插入到TK 基因中构建了TK- /LacZ 突变 株。 nTK- /gC-疫苗株：由Kit 等（1987）构建； nTK- /gG-疫苗株： nTK- /gE-疫苗株： n四川农业大学动物生物技术中心于1999 年在国内首次成功构建了PRV TK- /gI- /gp63- /LacZ 三基因缺失株，并在此基础上自行研制出了中国 第一株动物病毒基工程疫苗，即伪狂犬病