李芳重组梅毒螺旋体抗原tpn17纯化及基于金磁微粒梅毒螺旋体抗体的检测（西北大学硕士学位答辩ppt）课件

重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化及基于 金磁微粒梅毒螺旋体抗体的检测 答 辩 人: 李 芳 专 业: 细胞生物学 导 师: 崔亚丽 教授 1 主要内容 主要内容 梅毒和金磁微粒概述 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化和标记及其滴 度测定 应用金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩2 梅毒概述 西北大学硕士研究生论文答辩 梅毒（Syphilis） 是一种由梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）引起的性传 染病，发病率逐年递增 。因此，梅毒已经成为一个严重的公共 卫生问题。 检测方法 梅毒概述 3 梅毒螺旋体检测方法比较 方法优点缺点 暗视野显微镜法 快速、直接 阳性率较低 免疫荧光染色法 可区分梅毒螺旋体与其它 条件致病性螺旋体 可导致假阴性 性病研究实验室试验 操作简便，成本低廉 对一期梅毒敏感性不高 快速血浆反应素环状卡片试验 肉眼即可读出结果 对一期梅毒敏感性不高 梅毒螺旋体血球凝集试验 敏感性和特异性较好 易造成判断差错 荧光密螺旋体抗体吸收试验敏感性好不能判断治疗情况 梅毒螺旋体明胶凝集试验 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验 特异性高 很高的灵敏度和特异性 成本高，不能自动化 西北大学硕士研究生论文答辩 梅毒概述 4 西北大学硕士研究生论文答辩 金磁微粒概述 金磁微粒概述 定义 金磁微粒(Fe3O4/Au)是结合磁性氧化物粒子和 胶体金特点的新型磁性复合微粒。 磁性粒子聚集体 纳米金粒子 5 应用金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体示意图 HRP-TpAgTpAbTpAgGoldmag 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩6 研究内容、意义 西北大学硕士研究生论文答辩 研究内容及意义 运用阳离子交换层析纯化梅毒螺旋体抗原Tp17并对其进行 HRP标记，以双抗原夹心法测定纯化及标记抗原的滴度 以金磁微粒为固相载体，建立检测血液中梅毒螺旋体抗体的 方法，为将金磁微粒应用于临床检验提供实验依据 7 实验一:重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 l应用CM介质对抗原进行纯化研究 l纯化抗原的标记及其滴度测定 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 西北大学硕士研究生论文答辩8 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的表达 Tp17抗原最佳 (NH4)2SO4沉淀饱和度的确定 离子交换层析条件的选择与样品的预处理 SDS-PAGE分析纯化结果 纯化抗原的浓度测定 纯化抗原的标记及其滴度测定 西北大学硕士研究生论文答辩9 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的表达 西北大学硕士研究生论文答辩 每24 h 补加甲醇一次，连续诱导96 h 新鲜菌落接入25 mL YPD培养基中 30，280 r/min 培养过夜 1,500 r/min 离心5 min，弃上清 菌体用100 mL BMMY培养基悬浮，培养 收集培养物上清 采用本实验保存的重组体对Tp17抗原进行表达，分为生长和诱导两个阶段 10 Tp17抗原最佳(NH4)2SO4沉淀浓度 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 (NH4)2SO4分级沉淀Tp17抗原的培养物上清SDS-PAGE M: 标准蛋白质分子量; 1-3: 分别为70%、50%和30%浓度的(NH4)2SO4 西北大学硕士研究生论文答辩 Bradford法测定70%、50%和 30% (NH4)2SO4 沉淀后的蛋白 浓度分别为0.72mg/mL、 0.60mg/mL和0.11mg/mL 11 选择CM高流速琼脂糖微球（CM Bio-Sep FF，pH工作范围： 6-10）作为纯化蛋白的层析介质，对上样缓冲液pH值及洗脱缓冲 液离子强度进行了确定 SDS-PAGE对纯化抗原的鉴定 层析系统的选择 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 西北大学硕士研究生论文答辩12 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 上样缓冲液pH值的选择 Tp17抗原与介质结合后的上清SDS-PAGE M: 标准蛋白质分子量; 1-5: 分别为pH为6.4、6.9、7.4、7.9和8.4的上样缓冲液 西北大学硕士研究生论文答辩 当pH值为6.9时，Tp17抗 原溶液上清中未结合的目的 蛋白最少，这说明在该pH值 下Tp17带上了正电荷从而 与CM中的负电荷进行交换结合 在了树脂上。 13 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 洗脱缓冲液离子强度的选择 吸光度值 (nm) 盐离子浓度(mol/L) 层析洗脱体积 (mL) Tp17抗原的阳离子交换层析纯化 SDS-PAGE鉴定纯化的Tp17抗原 M: 标准蛋白质分子量; 1, 2: 峰3洗脱液 西北大学硕士研究生论文答辩 在pH 6.9 、20 mmol/L PB上样的条件下，以0-1.0 mol/L NaCl缓冲系统， 对Tp17抗原溶液进行不连续离子浓度梯度洗脱，分离目的蛋白，并用 SDS-PAGE对收集到的目的蛋白进行鉴定。 14 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 总上样量为9mL Tp17样品通过离子交换层析纯化 后，经SDS-PAGE鉴定，杂蛋白基 本去除，获得了纯度较高的目的蛋 白。 Tp17抗原溶液纯化前和纯化后的SDS-PAGE M: 标准蛋白质分子量; 1: 纯化前; 2: 纯化后 西北大学硕士研究生论文答辩 纯化放大实验 15 HRP标记Tp17抗原 5 mg HRP，平衡至室温后溶于800L 超纯水中 逐滴加入新配的0.1 mol/L NaIO4溶液，搅拌20 min 1 mmol/L pH 4.4醋酸钠缓冲液，4 过夜透析 升高醛化HRP的pH到9.0，待标记抗原于pH 9.5CBS中4透析2 h 抗原标记，过夜透析后(NH4)2SO4 沉淀 透析后离心收集上清物即为酶结合物 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 西北大学硕士研究生论文答辩16 HRP标记Tp17抗原滴度测定 包被抗原量和HRP-标记抗原滴度的方阵试验 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 西北大学硕士研究生论文答辩 标记抗 原稀释度 包被抗原量 (ng/孔) 100200300400500 1:200 P N 0.545 0.000 0.715 0.002 0.992 0.000 1.483 0.003 1.375 0.002 1:400 P N 0.765 0.001 0.832 0.001 1.082 0.000 1.243 0.005 1.300 0.004 1:800 P N 1.005 0.000 1.186 0.000 1.732 0.002 1.943 0.004 2.509 0.002 1:1,600 P N 0.875 0.001 0.947 0.000 1.634 0.003 1.821 0.002 1.934 0.000 1:3,200 P N 0.582 0.002 0.634 0.004 1.112 0.001 1.201 0.005 1.232 0.003 1:6,400 P N 0.564 0.004 0.600 0.003 0.794 0.001 0.834 0.000 1.169 0.000 17 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 表达并成功纯化了梅毒螺旋体抗原Tp17。用CM介质装成层析柱， Tp17 最佳纯化条件是在pH 6.9、20mmol/L PB 的条件下上样， 目的抗原约在0.6mol/L NaCl 的条件下被洗脱下来。 通过SDS-PAGE鉴定可得到高纯度的Tp17，经Bradford法测定所得到 的蛋白浓度为0.66mg/mL。 双抗原夹心法测定HRP-标记抗原的滴度为1:3,200。 小结 西北大学硕士研究生论文答辩18 实验二:以金磁微粒为载体检测梅毒螺旋体抗体 运用纯化的Tp17抗原建立梅毒螺旋体抗体磁分离酶联 免疫检测方法并将该方法初步应用于血液筛查 运用商品化重组梅毒螺旋体抗原Tp15、Tp17和Tp47， 完善上述方法 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩19 金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体方法的建立 Tp抗原在金磁微粒表面的固定化和封闭 Tp17抗原用于双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体 临界值的确定 血液筛查中的应用 商品化抗原Tp15、Tp17 和Tp47用于双抗原夹心法 检测梅毒螺旋体抗体 温育时间的选择 精密度分析 灵敏度分析 血液筛查中的应用 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩20 波长/ nm 1：固定前 2：固定后 吸光度值 固定前后抗原溶液特征吸收光谱 Tp抗原在金磁微粒表面的固定化和封闭 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 固定前抗原溶液在280 nm 处 具有明显的光吸收，固定后 上清液在280 nm 处无特征光 吸收，说明大部分抗原均固 定在金磁微粒表面。 21 Tp17抗原用于检测梅毒螺旋体抗体条件优选 固定抗原量和HRP-标记抗原稀释度的方阵试验 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 标记抗 原稀释度 固定抗原 量(ng/孔) 300420480540600 1:200 P N 0.251 0.011 0.502 0.007 0.792 0.009 0.983 0.007 1.232 0.005 1:400 P N 0.387 0.005 0.519 0.007 0.882 0.009 0.987 0.011 1.301 0.004 1:800 P N 0.575 0.004 0.486 0.004 1.532 0.002 1.543 0.000 1.509 0.002 1:1,600 P N 0.675 0.004 0.774 0.000 1.734 0.003 1.721 0.004 1.743 0.005 1:3,200 P N 0.582 0.002 0.634 0.004 1.312 0.001 1.301 0.005 1.432 0.003 由表中结果可看出：Tp17 抗原的固量480 ng/孔， HRP-标记抗原的稀释度 1:1,600为最优反应条件 22 临界值的确定 平均OD值：X= 0.050 标 准 偏 差：SD = 0.014 阴性血清OD值分布 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 按照以下方法： P/N 2.1，可以得COV = 0.105 23 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 194份血样筛查结果 0.0320.1000.0870.0540.0670.0790.0960.0940.0750.0400.0650.0340.041 0.0300.0540.0540.0980.0590.0990.1010.1000.0870.0260.0460.0240.052 0.0850.0450.0870.0340.0640.0760.0650.0250.0750.0800.0260.0740.092 0.0650.0760.0750.0870.0730.0650.0650.0450.0730.0460.0730.0620.050 0.0300.0410.0630.0620.0620.0290.0360.0400.0400.0510.0740.0400.049 0.0540.0990.0490.0640.0690.0740.0810.0360.0400.0400.0390.0600.041 0.0750.0240.0640.0340.0420.0450.0740.0770.0750.0450.0640.0430.030 0.0980.0650.0430.0640.0450.0750.0450.0520.0610.0360.0630.0400.032 0.0540.0340.0260.0730.0710.0460.0460.0570.0410.0730.0290.0560.031 0.0350.0350.0500.0420.0480.0410.0280.0410.0410.0470.0510.0700.040 0.0520.0500.0500.0470.0430.0390.0600.0820.0910.0740.0790.0430.027 0.0520.1020.0632.0310.0320.0950.0730.0620.0740.0350.0530.0720.094 0.0340.0740.0420.0850.0840.0920.0900.0720.0770.0750.0440.0990.035 0.0840.0730.0720.0560.0660.0660.0450.0820.0900.0910.0760.0430.058 0.0890.0730.0470.0610.0350.0740.0420.0500.0720.0720.0640.029 阳性率为0.5%，与试剂盒检测结果一致 24 不同时期梅毒患者血清检测结果 1.0351.0061.6321.0941.103 0.9831.3210.2910.5940.998 1.7011.1051.0001.1070.749 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 15例早期患者血清检测结果 15例晚期患者血清检测结果 0.9131.1351.0641.0010.953 0.6010.8420.4061.0000.854 0.9340.9890.0760.0400.053 Tp17抗原对早期感染血清抗体更 为敏感，对晚期感染者存在一定 的漏检，这一检测结果与国内外 报道一致。与Tp15和Tp47抗原相 联合，可提高检测灵敏度 25 与商品化Tp17抗原的比较 用纯化Tp17、商品化Tp17和商品化重组抗原Tp15、Tp17和Tp47 分别包被金磁微粒用来检测梅毒螺旋体抗体 纯化抗原商品化抗原商品化重组 抗原 阳性对照1.5391.5532.034 阴性对照0.0010.0030.001 抗原来源 结果 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 由表中结果可看出：单一纯化抗原和商品化抗原在检测结果上基 本相同，但与混合抗原相比存在一定的差别 26 双抗原夹心法方阵试验结果 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 标记抗 原稀释度 固定抗原 量(ng/孔) 120240420480540 1：1000 P N 0.228 0.003 0.505 0.005 1.278 0.003 1.300 0.007 1.314 0.000 1：2000 P N 0.399 0.002 0.689 0.007 1.285 0.003 1.500 0.010 1.498 0.005 1：3000 P N 0.421 0.000 0.668 0.004 1.372 0.003 1.380 0.003 1.374 0.003 1：4000 P N 0.621 0.006 0.957 0.010 1.747 0.005 1.763 0.004 1.760 0.007 1：5000 P N 0.475 0.006 0.501 0.007 0.742 0.004 0.751 0.005 0.760 0.005 1：6000 P N 0.206 0.010 0.343 0.013 0.673 0.006 0.700 0.009 0.712 0.006 商品化抗原Tp15、Tp17 和Tp47用于双抗原 夹心法检测梅毒螺旋体抗体 由表可看出：金磁微 粒表面固定抗原量 420 ng/孔，HRP-标记 抗原的稀释度1:4,000 定为最优反应条件。 27 吸光度值随温育时间的变化 温育时间的选择 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 本实验中，选用温育时间为30 min，此时抗原抗体反应已达平衡，且 时间波动对吸光度值影响较小。 28 精密度分析 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 批次检测结果 平均值CV值 (%) (批内-) 1 P N 1.262 0.002 1.319 0.000 1.363 0.003 1.279 0.003 1.336 0.005 1.2783.23 2 P N 1.458 0.015 1.400 0.019 1.378 0.007 1.506 0.001 1.432 0.005 1.4013.58 3 P N 1.253 0.005 1.285 0.010 1.219 0.000 1.345 0.000 1.246 0.006 1.2203.96 4 P N 1.167 0.004 1.294 0.003 1.282 0.001 1.205 0.010 1.242 0.004 1.1924.46 5 P N 1.285 0.008 1.230 0.004 1.198 0.003 1.245 0.005 1.276 0.015 1.2022.94 CV值(%) (批间-)6.82 批内CV值均在5%以下，批间CV值为6.82%，免疫学载体 要求不高于15%。表明金磁微粒可作为一种理想的梅毒螺 旋体抗体检测载体。 29 灵敏度分析 金磁微粒检测系统与试剂盒灵敏度比较 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 稀释度 检测结果 金磁微粒检测系统 试剂盒检测系统 1:50 + + 1:100 + + 1:200 + - 1:400 + - 1:800 + - 1:1600 + - 1:3200 - - 金磁微粒检测系统的灵敏度至少是商品化试剂盒灵敏度的10倍。 30 血液筛查中的应用 金磁微粒与试剂盒的符合率为98.4% 检测15例早期病人和15例晚期病人血清，检测结果与试剂盒和 临床诊断结果完全一致，运用Tp15、Tpl7和Tp