生殖免疫学检查方法ppt课件

生殖免疫学检查方法 中山大学第二附属医院妇产科 刘玉昆 复发性自然流产病因复杂，包括解剖、 内分泌、遗传、感染等因素，但仍有 50%以上的患者病因不明 大部分原因不明的复发性自然流产患者 与免疫因素有关，包括自身免疫和同种 免疫 常用的生殖免疫学检查方法 基本原理 在复发性自然流产诊治中的价值和 地位 抗磷脂抗体 抗磷脂抗体属一类针对各种带负电荷磷 脂的自身抗体，临床上常与复发性动静 脉血栓形成、复发性自然流产、血小板 减少症等密切相关 磷脂抗体的靶抗原实际上是磷脂/磷脂结 合蛋白复合物 能形成此复合物的磷脂有：磷脂酰丝氨 酸、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇 、磷脂酰酸、磷脂酰胆碱等，因此形成 相应的多种磷脂抗体 抗心磷脂抗体和狼疮抗凝因子 抗磷脂抗体是一种强烈的凝血活性物质 ，激活血小板，促进凝血，导致血小板 聚集，血栓形成 同时可直接造成血管内皮细胞损伤，加 剧血栓形成，使胎盘循环发生栓塞，胎 盘梗死，导致流产 直接影响绒毛滋养细胞的生长、分化与 侵入 抗磷脂抗体与复发性自然流产关系密切 曾经有过自然流产史并且ACA高水平者 ，RSA发生率达70%，曾经自然流产3次 ，ACA阳性者，再次自然流产机率可达 90% RSA患者APA阳性发生率15-20%，而无 自然流产者阳性率为2-5%，且其中ACA 阳性者大部分为低度阳性 Harris等调查1000名非选择性产科病人， 结果2%患者ACA IgG阳性，4% IgM阳性 ，其中80%是弱阳性，只有0.2%的IgG和 0.7%的IgM为中、重度阳性 狼疮抗凝因子（LA） 1952年， Conley和 Hartmam发现两位因 凝血酶原时间和全血凝块时间延长而有 出血性疾病的SLE患者中存在一种“抗凝 物”，1972年正式命名其为LA 是抗磷脂抗体的一种 LA的实验室检查 在体外实验中，LA能通过与磷脂表面结 合而阻断钙依赖性的凝血酶原酶复合物 的形成，从而使APTT延长。 筛查实验： 活化部分凝血活酶时间（APTT） 进一步确证实验 在患者血浆中加入正常血浆， APTT延长 不能得到纠正 在血浆中加入过量磷脂，APTT可以得到 纠正 某些药物也可导致的LA生成，如 hydralazine ,chlorpromazine, procainamide 药物导致的LA在停药后可逐渐消除 应用抗凝剂时会影响LA的测定结果 注 意 抗心磷脂抗体（ACA） 抗心磷脂抗体的检测方法目前最常用的 为酶联免疫吸附法（ELISA） 原理：酶标板经牛心磷脂包被，以含 20%成年牛血清的PBS 封板，加入稀释 的待测血清，孵育1小时，洗涤，加HPH -抗人IgG，洗涤后加底物，于酶标仪上 判断结果 注意问题 感染性疾病（如梅毒、疟疾、甲肝、丙肝、 结核、爱滋病、巨细胞病毒、B19微小病毒等 ）可使 ACA呈阳性反应 阳性者需68周后复查 ACA检验结果应以阴性、弱阳性、中度 阳性、强阳性表示，少部分正常人呈弱 阳性，以中度阳性、强阳性的临床意义 最大 ACA的检测结果受靶抗原浓度、酶标板 的敏感度、合适的缓冲液等影响，因此 各实验室的检验结果可能有一定差异 ACA作用的靶抗原实际上是磷脂与2糖 蛋白的抗原复合物，因此在磷脂抗体 ELISA检测系统中，必须提供足够量与浓 度稳定的2糖蛋白。 ACA和LA有密切相关性，但二者不同， 因此二者都应检测 抗磷脂抗体与不孕 抗磷脂抗体能否引起不孕？ 反复IVF失败者是否需检测抗磷脂抗体？ 阳性者是否需治疗？ 报道不一致 系统综述表明： 抗磷脂抗体引起不孕的证据不足 不支持对IVF失败者常规进行抗磷脂抗体的 检测 对抗磷脂抗体阳性的不孕患者是否需 要干预还有争议 抗核抗体（ANA） ANA是指针对细胞核内成分所产生的抗 体 细胞核内成分复杂，有核糖核酸、脱氧 核糖核酸、酶、蛋白等，抗核抗体是指 抗细胞核内的RNA、DNA，各种酶和蛋 白质等的总称 包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非 组蛋白抗体、抗核仁抗体 临床上常用的测定方法为间接免疫荧光 检测 ANA并不象ACA一样与RSA与密切关系 尽管ANA在RSA中似乎更常见，但他们 的存在并不能预测妊娠的结局 与自然流产 有关？ Fausett总结了目前的研究资料，认为： ANA阳性可能只是提示机体其它自身抗 体（特别是APL）的存在 例如有三项研究发现在RSA患者中，ANA阳 性者其APL的阳性率分别为17%、71%、 100%。 没有合理、有效的治疗手段 不支持在RSA患者中常规进行ANA筛查 不支持对不孕患者常规进行ANA的 检测 抗精抗体（ASA） 抗精抗体是机体产生的针对精子抗原的 抗体 由于机械屏障的破坏、炎症等原因，男 女双方的机体内可产生抗精抗体 男方还是女方 产生的部位 何种检查方法 抗精抗体检测技术 1. 以精子膜提取物抗原检测体液标本精 子抗体的方法：如酶联免疫吸附法 敏感、高效、检测样本用量少，主要用 于检测血清中的抗精抗体 提取过程对蛋白分子的损伤，膜内侧的 成分等可能与血清中存在的自身抗体发 生结合 以酶联免疫试验检测血清、宫颈黏液的 抗精子抗体，不明原因不育夫妇及抗体 阳性妇女间体外受精和妊娠率，并无明 显差别 以精子膜提取物作为抗原的检测技术仍 有很大缺陷 2. 以活动精子检测体液标本中精子抗体的方法 ：如凝集试验、精子制动试验等 以活精子作为抗原载体，有助于排除精子内部 成分的干扰 精浆中的精子抗体主要以与精子结合的形式存 在，因此本法主要用于检测血清标本 血清中的精子抗体难以直接作用于精子表面， 并干扰生殖，其临床意义尚难以确定 3. 活精子表面附着抗体的检测：如免疫珠试 验和混合抗球蛋白反应试验 用抗人免疫球蛋白抗体包被的聚丙烯酰胺微 球能结合于结合了精子抗体的精子表面，在 相差显微镜或电子显微镜下可见到此种免疫 珠随精子向前进而移动。 判断标准为表面有免疫求蛋白的精子在总活 动精子中所占的比例 按照世界卫生组织人类不育的病因 诊断分来，诊断免疫因素不育的唯 一依据为活动精子表面附着免疫求 蛋白。相应技术为免疫珠试验和混 合抗球蛋白反应试验 干扰精子穿过宫颈黏液、透明带及卵细胞膜 ，使受孕率降低 抗精抗体免疫性不孕 抗精抗体自然流产 抗精抗体与流产 尚无定论 有报道：引起自然流产的抗精抗体主要 是女方血清中的抗精抗体 其机理可能为ASA作用于滋养层细胞， 从而影响胚胎的生长发育，导致流产 封闭抗体的检测 母胎免疫耐受的机制之一：封闭抗体 胚胎所携带的夫源性 HLA抗原（滋养细胞 表面）能刺激母体免疫系统，并产生一类 IgG型抗体，称之为封闭抗体。 封闭抗体一方面可与母体淋巴细胞表面抗原 结合，也可与滋养细胞本身结合从而阻断母 胎之间的免疫识别和反应 习惯性流产患者常缺乏封闭抗体，使母体免 疫系统容易对胎儿产生免疫攻击，导致流产 以此为依据，对缺乏保护性抗体的患者采用 异体免疫治疗，封闭抗体转为阳性后再妊娠 ，成功率显著提高 目前国际上许多医疗中心把封闭抗体的测定 作为复发性自然流产免疫治疗的指征之一， 并用于判定疗效 封闭抗体检测方法 补体依赖性细胞毒实验 单向混合淋巴细胞反应 流式细胞仪检测抗丈夫淋巴细胞抗体 补体依赖性细胞毒试验 基本原理：女方血清内存在的封闭抗体与男 方外周血淋巴细胞结合，并在补体介导作用 下致细胞细胞死亡，经胎盘蓝或伊红染色， 在相差显微镜下读取死细胞数及计算细胞毒 指数，细胞毒指数 20%为阳性。 单向混合淋巴细胞反应检测封闭抗体 基本原理：用男方外周血淋巴细胞经丝裂霉 素处理后作刺激细胞，女方外周血淋巴细胞 作为反应细胞做单向混合淋巴细胞培养。在 实验中，让女方血清作为培养基质，与AB 型供者血清作培养基质比较，观察这两种基 质对一对夫妇妇方外周血淋巴细胞对男方外 周血淋巴细胞反应的影响。计算出封闭效率 ，封闭效率大于5%时为封闭效率阳性 流式细胞仪检测抗丈夫淋巴细胞抗体 女方血清丈夫淋巴细胞 共培养 PE FITC 尽管目前许多实验室用封闭抗体来评价患者的 同种免疫状况，并且对临床也有一定的指导价 值，但由于目前母胎免疫耐受的机制尚未完全 阐明，封闭抗体只是导致自然流产的可能机制 ，目前为止，尚无直接证据，因此只能作为一 个参考。 并且即使在正常妊娠，封闭抗体也会阴性 另外有研究发现，B细胞缺乏鼠仍可成功妊娠 。 NK细胞毒性测定 NK细胞毒性测定是目前一种比较新的评 价习惯性流产患者免疫状况的方法。 研究表明妊娠期母体外周血NK细胞活性 明显下降，而在RSA患者孕期及非孕期 的外周血NK细胞活性均较正常妇女明显 升高，并且与妊娠结局直接相关。应用 免疫球蛋白或淋巴细胞免疫治疗后，NK 细胞毒性明显下降，且有良好的妊娠结 局 NK细胞毒性测定已成为诊治 自然流产患者的检测指标之一 NK细胞毒性测定 方法 流式细胞仪法 流式细胞仪测定NK细胞毒性 靶细胞PKH2NK细胞 共培养PI 死亡靶细胞PI PKH2 NK细胞毒性测定结果 NK细胞毒性大于15%将明显损害胚胎， 在妊娠前及妊娠后必须将其降至15%以 下。 降低NK细胞毒性的方法有静脉滴注丙种 球蛋白和淋巴细胞免疫治疗 周期第6、7、8天用球蛋白3天，48小时 后测NK细胞毒性 抑制 受孕 未抑制 每月检测NK细胞毒性，直至抑制 后受孕 淋巴细胞免疫治疗，封闭抗体阳性后， NK细胞毒性可下降50%左右，因此对球 蛋白无效者可用，也可直接用（经济） 妊娠后，应每月复查NK细胞毒性，使其 低于15% 妊娠后才检测NK细胞毒性高者，如 B超 、HCG正常，可用免疫球蛋白，但效果 不如孕前用，如不用结局更差 抗甲状腺抗体 Stagnaro 等首次报道抗甲状腺抗体与妊娠丢失 有关，后来不少学者相继报道。 Pratt等的研究表明，在抗甲状腺抗体阳性的 RSA患者中，其ACA 阳性率没有增高，提示抗 甲状腺抗体可能是RSA的一个独立危险因素。 Singh等研究发现，抗甲状腺抗体阳性患者中， 自然流产发生率达32%，而阴性组为16%。 Steck等研究发现在RSA组中，抗甲状腺抗体阳 性率为36%，而在正常对照组为9%（初产妇） 4.5%（经产妇）。 然而也有一些相反的报道，认为抗甲状 腺抗体与RSA无关。 综合文献报道，目前大多数报道认为抗 甲状腺抗体阳性与RSA有关，但尚缺乏 直接证据。 抗甲状腺抗体导致流产的